हम ब्रॉडबैंड उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी के साथ रासायनिक छवियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक एसआरएस माइक्रोस्कोप के आधार पर जो अंतर मल्टीचैनल-लॉक-इन डिटेक्शन के साथ संचालित होता है, प्रोटोकॉल नमूना तैयारी, एसआरएस तंत्र के समायोजन और रासायनिक रूप से विषम नमूनों के विभिन्न घटकों को विसर्जित करने के लिए केमोमेट्रिक्स का वर्णन करता है।
उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी लेबल मुक्त रासायनिक इमेजिंग के लिए एक गैर-रेखीय ऑप्टिकल तकनीक है। यह विश्लेषणात्मक उपकरण सीधे उनके आणविक कंपन से पूछताछ करके पतली नमूनों की उच्च गति, और उच्च स्थानिक संकल्प पर रासायनिक मानचित्र प्रदान करता है। इसके मानक कार्यान्वयन में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी संकीर्ण बैंड है और एक समय में केवल एक ही कंपन आवृत्ति के साथ छवियों का निर्माण करता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण न केवल एसआरएस की रासायनिक विशिष्टता में बाधा डालता है बल्कि कंपन स्पेक्ट्रा के भीतर एन्कोडेड जानकारी के धन की भी उपेक्षा करता है।
इन सीमाओं को ब्रॉडबैंड एसआरएस द्वारा दूर किया जा सकता है, एक कार्यान्वयन जो समानांतर में छवि के प्रति पिक्सेल कंपन स्पेक्ट्रम निकालने में सक्षम है। यह हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा प्रदान करता है, जब केमोमेट्रिक विश्लेषण के साथ युग्मित होता है, तो नमूने से पुनर्प्राप्त जानकारी की मात्रा को अधिकतम करता है। इस प्रकार, ब्रॉडबैंड एसआरएस सिस्टम की रासायनिक विशिष्टता में सुधार करता है, जिससे नमूने के विभिन्न घटकों की एकाग्रता के मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति मिलती है। यहां, हम ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के साथ रासायनिक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जो एक कस्टम अंतर मल्टीचैनल-लॉक-इन एम्पलीफायर डिटेक्शन के साथ संचालित एक घर-निर्मित एसआरएस माइक्रोस्कोप पर आधारित है। यह नमूना तैयारी, एसआरएस तंत्र के संरेखण और केमोमेट्रिक विश्लेषण पर चर्चा करता है। कंपन रमन स्पेक्ट्रा प्राप्त करके, प्रोटोकॉल दिखाता है कि मिश्रण के भीतर विभिन्न रासायनिक प्रजातियों की पहचान कैसे करें, उनके सापेक्ष सांद्रता का निर्धारण करें।
रमन माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है जो रमन प्रकीर्णन1 को मापकर समृद्ध रासायनिक मानचित्र प्रदान करती है, एक अप्रत्यास्थ विकिरण प्रक्रिया जो घटना प्रकाश 2,3 के जवाब में कंपन करने वाले अणुओं से उत्पन्न होती है। रमन मानचित्र के प्रत्येक पिक्सेल में एक स्पेक्ट्रम होता है जो नमूने की रासायनिक संरचना और संरचना पर सीधी जानकारी रखता है, जिसके परिणामस्वरूप आंतरिक कंपन विपरीत के साथ छवियां होती हैं। आज तक, रमन माइक्रोस्कोपी आणविक कंपन के माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन के लिए संदर्भ दृष्टिकोण है क्योंकि कोई अन्य इमेजिंग तकनीक उच्च रासायनिक विशिष्टता और उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन4 दोनों के साथ छवियों का उत्पादन नहीं कर सकती है। इसकी उत्कृष्ट रासायनिक विशिष्टता के बावजूद, रमन प्रकीर्णन की पीढ़ी दक्षता कम है, या तो विस्तारित पिक्सेल निवास समय या उच्च शक्ति उत्तेजना के लिए बुला रही है, क्रमशः, कम अधिग्रहण दरों और संवेदनशील नमूनों के साथ असंगति के लिए अग्रणी।
रमन माइक्रोस्कोपी की इस एकल कमी ने शोधकर्ताओं को माइक्रोस्कोपी के लिए विपरीत स्रोत के रूप में सुसंगत रमन प्रकीर्णन 5,6,7,8,9 लागू करने के लिए प्रेरित किया। यह एक गैर-रेखीय ऑप्टिकल प्रक्रिया है जो परिमाण के कई (सात तक) आदेशों द्वारा कंपन प्रतिक्रिया को बढ़ाती है, इस प्रकार उच्च गति रासायनिक इमेजिंग10,11,12,13 की अनुमति देती है। विशेष रूप से, दो सबसे अधिक नियोजित सुसंगत रमन प्रकीर्णन तकनीक सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (सीएआरएस) 14 और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) 15 हैं। कारों के विपरीत, एसआरएस गुंजयमान अणुओं की एकाग्रता पर एक रैखिक निर्भरता दिखाता है। यह गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि के लिए प्रतिरक्षा है, किसी भी कंपन संक्रमण से असंबंधित एक गैर-रेखीय प्रभाव लेकिन आणविक कंपन16,17 के रमन स्पेक्ट्रा की लोरेंत्ज़ियन आकृतियों की विशेषता के लिए विकृत है। इस प्रकार, एसआरएस माइक्रोस्कोपी प्रामाणिक रमन जानकारी उत्पन्न करती है जो प्रत्यक्ष मात्रात्मक छवि विश्लेषण की अनुमति देती है।
एसआरएस एक तीसरा क्रम, गैर-रेखीय, ऑप्टिकल प्रक्रिया है जो एक नमूने के रासायनिक बांड पर सीधी जानकारी प्रदान करती है। यह आम तौर पर निकट-अवरक्त वर्णक्रमीय क्षेत्र में दो ऑप्टिकल क्षेत्रों के स्पैटिओटेम्पोरल सुपरपोजिशन से उत्पन्न होता है, अर्थात् पंप और स्टोक्स क्रमशः10,11,18 आवृत्ति पर 10,11,18 आवृत्तिπ पु और ωएस पर। यह सुपरपोजिशन पंप-स्टोक्स आवृत्ति डिट्यूनिंग पर एक धड़कन उत्पन्न करता है Ω =ω पु-ω एस। जब Ωआर Ω एक आणविक कंपन से मेल खाता है, तो अणु प्रतिध्वनित होता है, जिससे प्रकाश क्षेत्रों और अणु के बीच एक सुसंगत ऊर्जा हस्तांतरण होता है। नतीजतन, अणु कंपन रूप से उत्तेजित स्थिति तक पहुंच जाता है। इस प्रक्रिया को या तो पंप फोटॉनों के विनाश (उत्तेजित रमन हानि [एसआरएल]) या स्टोक्स फोटॉनों के सहवर्ती प्रवर्धन (एक प्रक्रिया जिसे उत्तेजित रमन लाभ [एसआरजी] के रूप में जाना जाता है) के विनाश को मापकर निगरानी की जा सकती है। एसआरजी और एसआरएल छोटे संकेत (ΠI) हैं जो एक तीव्र और उतार-चढ़ाव वाली पृष्ठभूमि (आई) के शीर्ष पर बैठते हैं। चूंकि एसआरएस सिग्नल (ΠI / I) के विशिष्ट मान 10-6-10-4 रेंज में हैं, इसलिए लेजर शोर आसानी से इसे अस्पष्ट कर सकता है। सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) पर लेजर शोर के हानिकारक प्रभावों को कम करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप इमेजिंग गति पर, एसआरएस का पता लगाने के लिए मॉडुलन हस्तांतरण तकनीकों (जैसे, लॉक-इन एम्पलीफायरों, गुंजयमान सर्किट, या बॉक्स-कार औसत) पर निर्भर करता है उच्च मॉडुलन आवृत्तियों (>1 मेगाहर्ट्ज), जहां लेजर शोर अपने न्यूनतम मूल्यों 15,19,20 तक पहुंचता है।
पारंपरिक एसआरएस माइक्रोस्कोपी एक एकल कंपन आवृत्ति पर रासायनिक छवियों का उत्पादन करने के लिए नैरोबैंड (≈10 सेमी -1) पंप और स्टोक्स दालों को नियोजित करती है, जिससे पिक्सेल निवास समय के साथ वीडियो-दर इमेजिंग ≈100 एनएस21,22 जितना कम हो जाता है। हालांकि, क्योंकि नैरोबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी केवल कुछ कंपन आवृत्तियों पर नमूने को क्रमिक रूप से स्कैन करके रासायनिक मानचित्र बनाती है, इसकी जानकारीसीमित है 23. एक या दो कंपन विरोधाभासों के साथ एसआरएस छवियां विशेष रूप से विषम प्रणालियों के भीतर ओवरलैपिंग रमन बैंड के साथ रासायनिक प्रजातियों को अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती हैं। इसलिए, प्रतिमान संकीर्ण बैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप एसआरएस की पूरी क्षमता का फायदा नहीं उठाता है, क्योंकि कुछ हद तक कंपन आवृत्तियों की जांच करने से इसकी रासायनिक विशिष्टता में बाधा आती है और कंपन स्पेक्ट्रा के भीतर एन्कोड की गई जानकारी के धन की उपेक्षा होती है। इसके अलावा, विभिन्न आवृत्तियों पर नमूने की अनुक्रमिक स्कैनिंग के परिणामस्वरूप विस्तारित पिक्सेल निवास समय होता है जो फोटोडैमेज को ट्रिगर कर सकता है और लगातार छवियों के बीच कठोर स्थानिक सह-पंजीकरण को रोक सकता है, जिससे गति कलाकृतियों की ओर अग्रसर होता है।
अपने संकीर्ण बैंड समकक्ष के विपरीत, ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी प्रत्येक नमूना स्कैन 10,12,24 पर पिक्सेल प्रति एक कंपन स्पेक्ट्रम को पुनः प्राप्त करता है। इस प्रकार, ब्रॉडबैंड एसआरएस विभिन्न कंपन विरोधाभासों के सख्त स्थानिक सह-पंजीकरण के साथ हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रदान करता है, जिससे कठोर डेटा विश्लेषण की अनुमति मिलती है। यह न केवल रमन स्पेक्ट्रा के माध्यम से नमूने के रासायनिक घटकों को प्रकट करता है, बल्कि उनके सापेक्ष सांद्रता को निर्धारित करने में भी मदद करता है। स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण कैसे किया जाता है, इसके आधार पर, ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी को या तो हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस या मल्टीप्लेक्स एसआरएस के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस में, नमूने के स्कैन किए गए बिंदु प्रति एसआरएस स्पेक्ट्रम को क्रमिक रूप से अधिग्रहित किया जाता है (यानी, इसे आवृत्ति डिट्यूनिंग Ω को व्यापक करके पुनर्प्राप्त किया जाता है), लगातार रमन शिफ्ट में एसआरएस संकेतों को एक साथ ढेर करके एसआरएस स्पेक्ट्रम का निर्माण किया जाता है। रमन स्पेक्ट्रम मल्टीप्लेक्स एसआरएस में कई कंपन मोड पर एक साथ मापा जाता है। इस प्रकार, मल्टीप्लेक्स एसआरएस दृष्टिकोण विभिन्न आवृत्तियों पर एसआरएस सिग्नल को चलाने के लिए ब्रॉडबैंड पल्स के साथ एक मॉड्यूलेटेड नैरोबैंड पल्स को जोड़ता है, और एसआरएस स्पेक्ट्रा का पता लगाने के लिए नैरोबैंड एसआरएस की तुलना में संवेदनशीलता के साथ एक मल्टीचैनल डिटेक्टर का उपयोग करता है।
यह पेपर मल्टीप्लेक्स एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विषम नमूनों के रासायनिक मानचित्रों का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में नियोजित एसआरएस माइक्रोस्कोप की एक योजना को चित्रा 1 में दर्शाया गया है और कहीं और25,26,27 के विस्तार से वर्णित किया गया है। संक्षेप में, एक वाणिज्यिक मोड-लॉक वाईबी फाइबर लेजर, 1040 एनएम पर केंद्रित 140 एफएस दालों का उत्पादन करता है, जिसमें 10 डब्ल्यू औसत शक्ति और 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर होती है, ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप को चलाती है। एक ध्रुवीकरण बीम स्प्लिटर (पीबीएस) मौलिक बीम को दो शाखाओं में अलग करता है। संकीर्णबैंड स्टोक्स दालों का उत्पादन करने के लिए, मौलिक बीम के 4 डब्ल्यू के साथ एक शाखा को एक एटलॉन में भेजा जाता है जो एक संकीर्ण बैंड (≈15 सेमी -1) बीम उत्पन्न करता है, जिसे तब एक ध्वनिक ऑप्टिक मॉड्यूलर (एओएम) के साथ 1.6 मेगाहर्ट्ज पर संशोधित किया जाता है। मौलिक बीम के 6 डब्ल्यू के साथ शेष अंश 2.8 मिमी मोटी लिथियम ट्राइबोरेट (एलबीओ) क्रिस्टल के साथ आवृत्ति-दोगुना हो जाता है, टाइप-आई चरण मिलान के लिए काटा जाता है (θ = 90 °, φ = 13.8 °)। 520 एनएम पर परिणामी दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (ओपीओ) को पंप करने के लिए एक्स-फोल्ड गुहा की यात्रा करती है, एक उपकरण जो 3.0 मिमी मोटी एलबीओ क्रिस्टल (प्रकार मैं चरण मिलान, π = 90 डिग्री, φ = 9.8 डिग्री) का उपयोग करता है, 680-910 एनएम वर्णक्रमीय क्षेत्र (चित्रा 2) के भीतर ब्रॉडबैंड ऑप्टिकल विकिरण ट्यून करने योग्य ब्रॉडबैंड ऑप्टिकल विकिरण देने के लिए सक्रिय माध्यम के रूप में। ये ब्रॉडबैंड दालें एसआरएस प्रयोगों में पंप के रूप में काम करती हैं और माइक्रोस्कोप उद्देश्य द्वारा प्रेरित फैलाव प्रभावों को पूर्ववत करने के लिए एक प्रिज्म कंप्रेसर का प्रचार करती हैं।
संपीड़न चरण के बाद, एक वाईवीओ4 बाइरेफ्रिंजेंट प्लेट के साथ संयुक्त एक π/2 वेवप्लेट, दो ऑर्थोगोनल रूप से ध्रुवीकृत प्रतिकृतियों का उत्पादन करता है जिनके पहचान विमान पर इलेक्ट्रॉनिक घटाव ब्रॉडबैंड पंप के शोर को रद्द कर देता है। एक डाइक्रोइक दर्पण पंप और स्टोक्स बीम को जोड़ता है और उन्हें एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में भेजता है। 1.27 के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ एक जल-विसर्जन उद्देश्य नमूने पर प्रकाश पर केंद्रित है, जबकि 1.4 के एनए के साथ एक तेल-विसर्जन उद्देश्य इसे एकत्र करता है। पता लगाने के चरण से पहले, एक शॉर्ट-पास फ़िल्टर (एसपीएफ़) मॉडुलित स्टोक्स को हटा देता है, जबकि लिट्रो कॉन्फ़िगरेशन में एक विवर्तन झंझरी ऑपरेटिंग प्रेषित ब्रॉडबैंड पंप को फैलाता है। एक दूसरा पीबीएस2 पंप प्रतिकृतियों को अलग करता है, और एक लेंस उन्हें दो फोटोडायोड सरणियों पर केंद्रित करता है। इन फोटोडायोड सरणियों से संकेतों को इलेक्ट्रॉनिक रूप से घटाया जाता है और घर-निर्मित मल्टीचैनल-लॉक-इन एम्पलीफायर (एम-एलआईए) को भेजा जाता है। डिमोड्यूलेटेड सिग्नल को तब फोटोडायोड सरणियों में से एक के प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) रीडिंग द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, इस प्रकार एसआरएल स्पेक्ट्रम का उत्पादन होता है।
एक अनुकरणीय प्रयोग के रूप में, हम कई प्रसिद्ध रमन प्रकीर्णकों के मिश्रण की छवि बनाते हैं, प्रत्येक एक अद्वितीय रमन स्पेक्ट्रम के साथ। इस प्रकार, प्रोटोकॉल संदर्भ नमूने तैयार करने के तरीके का वर्णन करके शुरू होता है। जैसा कि हम एसआरएल का पता लगाते हैं, हम यह समझाते हैं कि संकीर्ण बैंड स्टोक्स दालों को कैसे प्राप्त किया जाए और ऑप्टिकल स्रोत स्थापित किया जाए जो ब्रॉडबैंड (≈250 सेमी -1) पंप दालों को वितरित करता है, अर्थात्, होमबिल्ट ओपीओ। प्रोटोकॉल ऑप्टिकल बीम के संरेखण और अनुकूलन को दर्शाता है, जो संकीर्ण बैंड स्टोक्स और ब्रॉडबैंड पंप की शक्ति और स्पेक्ट्रा जैसे महत्वपूर्ण मापदंडों का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल ब्रॉडबैंड पंप के ऑप्टिकल पथ का विस्तार से वर्णन करता है क्योंकि इसके लिए विशेष ऑप्टिकल तत्वों की आवश्यकता होती है। यह यह भी बताता है कि पंप-स्टोक्स दालों के बीच स्पैटिओटेम्पोरल ओवरलैप को कैसे खोजना है और सापेक्ष तीव्रता शोर (आरआईएन) निर्धारित करने का एक व्यावहारिक तरीका दिखाता है, जो बदले में एसआरएस प्रयोगों के लिए सर्वोत्तम मॉडुलन आवृत्ति को परिभाषित करने में मदद करता है। फिर, हम पता लगाने की श्रृंखला के कार्य सिद्धांत और अंशांकन की व्याख्या करते हैं। अंत में, प्रोटोकॉल डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया, केमोमेट्रिक्स और छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन को दर्शाता है।
ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है जो एक विषम नमूने के रासायनिक घटकों की पहचान करने और विसर्जित करने के लिए प्रामाणिक रासायनिक विपरीत प्रदान करती है। इस विश्लेषणात्मक उपकरण की क्षमता कई शोध क्षेत्रों के लिए फायदेमंद हो सकती है, जिसमें सामग्री विज्ञान से लेकर हिस्टोपैथोलॉजी तक शामिल हैं। ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी का नकारात्मक पक्ष यह तथ्य है कि यह तकनीकी रूप से मांग कर रहा है; प्रयोगकर्ता को न केवल ब्रॉडबैंड लेजर स्रोतों पर पता होना चाहिए, बल्कि एसआरएस को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए लेजर दालों में हेरफेर करने की भी आवश्यकता है, एक संकेत जो बदले में, परिष्कृत पहचान योजनाओं के साथ मापा जाना चाहिए। यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो मल्टीप्लेक्स ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मिश्रित रासायनिक यौगिकों के रासायनिक मानचित्रों का उत्पादन करने के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। यद्यपि वर्णित कार्य कुछ लेजर भौतिकविदों और गैर-रेखीय माइक्रोस्कोपिस्टों के लिए तुच्छ हो सकता है, लेकिन ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लाभों में रुचि रखने वाले पाठकों के लिए यह मामला नहीं हो सकता है, जिनका वैज्ञानिक ज्ञान इन डोमेन के बाहर रहता है। इसलिए, हमने ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी में रुचि रखने वाले व्यापक दर्शकों का मार्गदर्शन करने के लिए हर कदम का विस्तार करने का लक्ष्य रखा।
हाथ में प्रोटोकॉल कई मजबूत और प्रसिद्ध रमन प्रकीर्णकों से बना एक सरल अभी तक स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से समृद्ध नमूना तैयार करने के तरीके को दिखाकर शुरू हुआ। हमने चर्चा की कि एसआरएस माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए आवश्यक ब्रॉडबैंड पंप और नैरोबैंड स्टोक्स बीम कैसे प्राप्त करें। चित्रा 5 सी एसएचजी और ओपीओ सेटअप की एक योजना दिखाता है। ध्यान दें कि लेंस एफ1 एसएचजी उत्पन्न करने के लिए एलबीओ1 पर मौलिक बीम पर केंद्रित है, जबकि एक डिक्रोइक दर्पण एसएचजी विकिरण को दर्शाता है और अवशिष्ट मौलिक बीम को प्रसारित करता है। एक दूसरा लेंस एफ2 एसएचजी बीम को जोड़ता है। जैसा कि एफ2 एफ1 > है, एसएचजी बीम को एफ2/एफ1 के बराबर कारक द्वारा विस्तारित किया जाता है। एक तीसरा लेंस एफ3 विस्तारित एसएचजी बीम को दूसरे प्रकार I एलबीओ क्रिस्टल (एलबीओ2) पर केंद्रित करता है जो π = 90 ° और φ = 29.0 ° पर काटा जाता है। उपर्युक्त एसजीएच (520 एनएम) के साथ एलबीओ 2 पंप करके, 680-910 एनएम रेंज के भीतर विकिरण एलबीओ2 से अंतर-आवृत्ति पीढ़ी (डीएफजी) के माध्यम से उभरेगा, दो बीम का उत्पादन करेगा: सिग्नल और आइडलर27 (चित्रा 5 डी, ई)। उत्तरार्द्ध को त्याग दिया जाता है जबकि पूर्व को एसआरएस प्रयोगों में नियोजित पंप दालों को वितरित करने के लिए ओपीओ गुहा में प्रवर्धित किया जाता है। 520 एनएम पर ओपीओ का पंप, अर्थात्, एसएचजी बीम, एसआरएस प्रयोगों (यानी, ओपीओ के सिग्नल बीम) के पंप के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए।
एसआरएस माइक्रोस्कोपी में इसके विपरीत माइक्रोस्कोप के फोकल स्पॉट पर उत्पन्न एक गैर-रेखीय संकेत से उत्पन्न होता है, एक संकेत जो किसी दिए गए समय पर नमूना विमान में बड़ी संख्या में फोटॉनों को सीमित करने की मांग करता है। यह फोटॉन कारावास एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) माइक्रोस्कोप उद्देश्य के साथ प्राप्त किया जाता है, लेंस की एक सरणी जो सिस्टम के स्थानिक संकल्प को भी सेट करती है: एनए जितना अधिक होगा, स्थानिक संकल्प उतना ही अधिक होगा। हालांकि, उच्च एनए उद्देश्यों को कांच के साथ घनी पैक किया जाता है, जो स्पंदित विकिरण के लिए सकारात्मक जीडीडी का परिचय देता है, एक आवृत्ति चहचहाना जो अंततः दालों39 के अस्थायी प्रोफ़ाइल को व्यापक बनाता है। इस प्रकार, माइक्रोस्कोप उद्देश्य द्वारा पेश किए गए जीडीडी ब्रॉडबैंड पंप दालों की अवधि को बढ़ा सकते हैं, जिससे यह स्टोक्स अस्थायी लिफाफे से भी अधिक लंबा हो सकता है और रमन सिग्नल के प्रभावी, सुलभ बैंडविड्थ को कम कर सकता है। इसके अलावा, यह विस्तार मापा एसआरएस स्पेक्ट्रम के वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल के विरूपण को भी पेश कर सकता है।
कार्स में, स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से प्रासंगिक संकेत तरंग दैर्ध्य पर उभरता है जो उत्तेजना क्षेत्रों से भिन्न होता है। एक साधारण फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब या चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे का उपयोग समय में सीएआरएस सिग्नल को एकीकृत करने के लिए किया जा सकता है, लेजर शोर को औसत करने के लिए हजारों दालों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है। इसके बजाय, एसआरएस सिग्नल एक मजबूत और उतार-चढ़ाव लेजर पृष्ठभूमि के भीतर एम्बेडेड एक बेहोश मॉडुलन हस्तांतरण के रूप में दिखाई देता है। क्योंकि यह मॉडुलन कमजोर है, लेजर शोर आसानी से इसे अभिभूत कर सकता है, इमेजिंग गति और एसआरएस माइक्रोस्कोप की संवेदनशीलता दोनों को कम कर सकता है। इसलिए, इमेजिंग से पहले, यह निर्धारित करने के लिए सापेक्ष तीव्रता शोर (आरआईएन) को मापना अनिवार्य है कि क्या लेजर उच्च गति वाले एसआरएस इमेजिंग के लिए उपयुक्त है और सबसे कम शोर के साथ मॉडुलन आवृत्ति का चयन करने के लिए। आरआईएन को माध्य ऑप्टिकल पावर () 40,41 द्वारा सामान्यीकृत लेजर के शोर शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व [डब्ल्यू2/हर्ट्ज इकाइयों के साथ] के रूप में परिभाषित किया गया है। दूसरे शब्दों में, आरआईएन विभिन्न आवृत्तियों (ईक्यू [4]) पर सामान्यीकृत लेजर उतार-चढ़ाव का वर्णन करता है।
(4)
इस प्रकार, आरआईएन एसआरएस प्रणाली का एक पैरामीटर है जो प्रयोगों के लिए आदर्श मॉडुलन आवृत्ति सीमा निर्धारित करता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 में जैतून का बार एसआरएस इमेजिंग के लिए आदर्श मॉडुलन आवृत्ति रेंज से पता चलता है। नैरोबैंड एसआरएस के मामले में, उपयोगकर्ता को पंप और स्टोक्स दोनों के आरआईएन को मापना चाहिए ताकि यह चुना जा सके कि इष्टतम प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए किस बीम को संग्राहक करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 से ध्यान दें, कि स्टोक्स बीम में पंप की तुलना में थोड़ा अधिक आरआईएन है, जिसका अर्थ है कि एसआरजी माप उनके एसआरएल समकक्षों की तुलना में शोर हो जाएगा। ब्रॉडबैंड एसआरएस के मामले में, बीम जिसे मॉडुलित किया जाना चाहिए वह संकीर्ण बैंड बीम है।
झंझरी का कोणीय फैलाव डी विवर्तन कोण को तरंग दैर्ध्य के एक समारोह के रूप में व्यक्त करता है, और इसे झंझरी समीकरण के व्युत्पन्न के रूप में परिभाषित किया गया है। लिट्रो विन्यास के लिए, कोणीय फैलाव समीकरण (5) द्वारा दिया गया है।
(5)
समीकरण (5) प्राप्त करने के लिए, हमने मान लिया α = β, एम /डी के लिए समीकरण (2) को हल किया और परिणाम को डीβ / डीλ में डाला। ध्यान दें कि लिट्रो कॉन्फ़िगरेशन में, β = सिन -1 (एमλ/2डी)। छोटे कोण सन्निकटन के भीतर, स्पेक्ट्रम के साथ स्थिति में परिवर्तन एफडीβ ≈ डीएल (चित्रा 10) है। इस प्रकार, समीकरण (5) में डीβ डालने से, हम रैखिक फैलाव की गणना कर सकते हैं, समीकरण (6) का उपयोग करके एनएम मिमी -1 की इकाइयों के साथ एक मात्रा:
(6)
1,851.85 खांचे / मिमी के साथ लिट्रो कॉन्फ़िगरेशन में संचालित विवर्तन झंझरी के लिए, डी = 540 एनएम। यदि हम ~ 789 एनएम पर प्रकाश के पहले क्रम के विवर्तन का उपयोग करते हैं, तो डी = 0.0027 रेड एनएम -1। एफ = 750 मिमी लेंस के साथ, हमें 0.5 एनएम मिमी -1 ≈ का रैखिक फैलाव मिलता है, जो 7.8 सेमी –1मिमी -1 ≈ में अनुवाद करता है। इस प्रकार, लेंस की फोकल लंबाई डिटेक्टर विमान पर एनएम प्रति मिमी के “घनत्व” को निर्धारित करती है: फोकल लंबाई जितनी लंबी होगी, प्रति मिमी कम एनएम प्राप्त होगा, ब्रॉडबैंड पंप की वर्णक्रमीय लाइनों के बीच की जगह बढ़ जाएगी। इसके विपरीत, छोटी फोकल लंबाई के साथ, डिटेक्टर विमान पर प्रति मिमी अधिक एनएम होगा, जिससे बिखरे हुए पंप द्वारा कब्जा किए गए स्थान को कम किया जा सकेगा।
संतुलित पहचान छवि की गुणवत्ता और शोर सेटअप की संवेदनशीलता में सुधार करती है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 में दिखाए गए आरआईएन स्पेक्ट्रा के अनुसार और 1 एक्स 10-5 के आयाम के साथ विशिष्ट एसआरएस पर विचार करते हुए, असंतुलित सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) ≈60 है। संतुलित पहचान (यानी, शॉट-शोर के करीब) का उपयोग करके, ≈145 के एसएनआर को प्राप्त करना संभव है। चित्रा 11 संतुलित और असंतुलित परिस्थितियों के तहत स्पेक्ट्रा और समग्र छवियों को दर्शाता है। स्वाभाविक रूप से, संतुलित पहचान के प्रभाव प्रयोगों के अंतिम परिणामों को प्रभावित करते हैं, अर्थात्, रासायनिक मानचित्र। इन परिणामों द्वारा समर्थित, हम इस बात पर जोर देते हैं कि संतुलित पहचान छवि की गुणवत्ता पर लेजर उतार-चढ़ाव के हानिकारक प्रभावों का मुकाबला करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यह उल्लेखनीय है कि संतुलित पहचान शोर लेजर के लिए सबसे उपयुक्त है, जैसे कि फाइबर ऑसिलेटर। शांत ऑप्टिकल प्रकाश स्रोतों (जैसे, ठोस-राज्य लेजर) के साथ काम करने वाले एसआरएस माइक्रोस्कोप को संतुलित पहचान की आवश्यकता नहीं हो सकती है।
प्रोटोकॉल इन बीम के दालों के बीच स्पैटिओटेम्पोरल ओवरलैप को खोजने के लिए नॉनलाइनर ऑप्टिक्स के आधार पर एक दृष्टिकोण भी बताता है। हमने मॉडुलित स्टोक्स बीम के रूप में एओएम के 0वें विवर्तन-क्रम के बजाय 1सेंट का उपयोग करने के फायदों का वर्णन किया। इसके अलावा, एसआरएस पीढ़ी दक्षता पर फैलाव के हानिकारक प्रभावों को प्रिज्म कंप्रेसर के माध्यम से उन्हें कम करने के तरीकों के सुझावों के साथ वर्णित किया गया था। इसके अलावा, प्रोटोकॉल बताता है कि प्रिज्म को कैसे संरेखित किया जाए और इष्टतम प्रदर्शन के लिए विचार करने के लिए तीन महत्वपूर्ण पहलुओं पर प्रकाश डाला जाए। हम न केवल एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए आरआईएन की प्रासंगिकता पर चर्चा करते हैं, बल्कि यह भी दिखाते हैं कि इसे लॉक-इन एम्पलीफायर के साथ कैसे मापा जाए और आरआईएन स्पेक्ट्रम के साथ, सर्वोत्तम मॉडुलन आवृत्ति को परिभाषित करें। एक ठोस उदाहरण के साथ, यह पेपर बताता है कि झंझरी समीकरण कैसे पहचान श्रृंखला को डिजाइन करने में मदद करता है। अंत में, प्रोटोकॉल वास्तविक एसआरएस डेटा के साथ, एसआरएस हाइपरक्यूब की संरचना और पारंपरिक रूप से उपयोग की जाने वाली वैज्ञानिक प्रोग्रामिंग भाषा के साथ इसका विश्लेषण कैसे करें।
इस प्रोटोकॉल की तीन मामूली सीमाएं हैं। सबसे पहले, इस योगदान में नियोजित पहचान योजना में एक गैर-पारंपरिक, मल्टीचैनल लॉक-इन डिटेक्टर होता है जिसे स्किओर्टिनो एट अल द्वारा डिजाइन और निर्मित किया जाता है 26 जैसा कि पहले25 का प्रदर्शन किया गया था, इस डिटेक्टर को ऑफ-द-शेल्फ संतुलित फोटोडायोड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यद्यपि यह संशोधन केवल डिटेक्टर से संबंधित है और प्रोटोकॉल को लगभग अपरिवर्तित छोड़ देता है, एक एकल-फोटोडायोड के साथ, किसी को उन सभी को एक बार में मापने के बजाय डिटेक्टर पर प्रत्येक वर्णक्रमीय घटक को स्कैन करने की आवश्यकता होती है। दूसरा, यह प्रोटोकॉल इनलाइन संतुलित पहचान को नियोजित करता है, जिसके लिए बीम पथ में कई ऑप्टिकल तत्वों को सम्मिलित करने की आवश्यकता होती है। ये ऑप्टिकल तत्व सिस्टम जटिलता को बढ़ाते हैं और ऑप्टिकल पावर और पल्स विस्तार के नुकसान का कारण बनते हैं।
इनलाइन संतुलित पहचान यह भी मांग करती है कि दो पंप प्रतिकृतियां नमूने से गुजरती हैं, एक ऐसी स्थिति जो प्रकाश-संवेदनशील नमूनों के लिए आदर्श नहीं हो सकती है, जैसे कि जीवित कोशिकाएं, या दृढ़ता से द्विध्रुवी लोगों के लिए जिसमें दो पंप प्रतिकृतियां विभिन्न ऑप्टिकल गुणों का अनुभव कर सकती हैं, इस प्रकार संतुलित पहचान को रद्द करना। तीसरा, प्रोटोकॉल एक होम-बिल्ट ओपीओ पर निर्भर करता है, एक ऐसा उपकरण जो आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है। हालांकि, ओपीओ द्वारा वितरित ब्रॉडबैंड स्पेक्ट्रा के विकल्प गैर-रेखीय ऑप्टिकल फाइबर या थोक क्रिस्टल से सुपरकॉन्टिनुआ हैं। उत्तरार्द्ध को केवल कम पुनरावृत्ति दर लेजर (5 मेगाहर्ट्ज तक) के साथ नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, हर प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ के रूप में, हाथ में प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं हैं। हालांकि, वे न्यूनतम हैं और इस दृष्टिकोण की सफलता से समझौता नहीं करते हैं।
यद्यपि यहां एक संदर्भ नमूना वर्णित है, यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं और पशु और पौधों के ऊतकों, जैसे कि सेल्यूलोज, लिपिडिक प्रजातियों, या प्रोटीन के भीतर रासायनिक प्रजातियों को सफलतापूर्वक विसर्जित कर सकता है, विभिन्न जैव रासायनिक खोजों में या हिस्टोपैथोलॉजी में निदान उपकरण के रूप में व्यावहारिक अनुप्रयोगों को ढूंढ सकता है। इसी तरह, यह प्रोटोकॉल भौतिक विज्ञान में एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, कोई भी आणविक संरचना और बहुलक प्रजातियों42 की एकाग्रता से पूछताछ कर सकता है। इसके अलावा, यह पद्धति अन्य गैर-रेखीय माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ संगत है, जैसे कि पंप-जांच43 और हेटरोडाइन कार्स44 के आधार पर ब्रॉडबैंड माइक्रोस्कोपी, चार-तरंग मिश्रण प्रक्रियाएं, जो एसआरएस के साथ, दो उत्तेजना प्रकाश बीम और मॉडुलन-हस्तांतरण माप की भी आवश्यकता होती है। अंत में, इस पत्र में निहित कुछ जानकारी को गैर-रेखीय इमेजिंग तकनीकों पर लागू किया जा सकता है जो मॉडुलन हस्तांतरण तकनीकों पर भरोसा नहीं करते हैं, लेकिन दो या दो से अधिक स्पंदित लेजर बीम को संरेखित करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि पारंपरिक कार्स45 और एसएफजी माइक्रोस्कोपी46।
संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल रासायनिक मानचित्रों और रासायनिक रूप से विषम मिश्रण से उनकी विशेषता एसआरएस स्पेक्ट्रा निकालने के लिए ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के आधार पर एक शक्तिशाली पद्धति का वर्णन करता है, जो डेटासेट प्रदान करता है जो सीधे मात्रात्मक डेटा विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि की बहुमुखी प्रतिभा और सादगी भी इच्छुक पाठक को इसे विभिन्न गैर-रेखीय तकनीकों के अनुकूल बनाने की संभावना देती है।
The authors have nothing to disclose.
डीपी अनुदान समझौते संख्या 101016923 के तहत यूरोपीय संघ परियोजना क्रिमसन और ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 101016923 के तहत रीजन लोम्बार्डिया प्रोजेक्ट न्यूमेड से वित्त पोषण स्वीकार करता है। पीओआर एफईएसआर 2014-2020। जीसी अनुदान समझौते संख्या 881603 के तहत यूरोपीय संघ परियोजना ग्राफीन कोर 3 से वित्त पोषण स्वीकार करता है। जीसी किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, ग्रांट अवार्ड नंबर: ओएसआर -2016-सीआरजी 5-3017-01 से वित्त पोषण भी स्वीकार करता है।
Collection objective | Nikon | CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon | Oil immersion objective |
Coverslips | Thermo Fisher | 043211-KJ | Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm |
Delay line | Physik Instrumente (PI) | M-406.6PD | Precision microtranslation stage, 150 mm travel range |
DMSO | Merck | D8418-500ML | Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide |
Etalon | SLS Optics Ltd | Custom made | Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring |
Excitation objective | Nikon | CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon | Water immersion objective |
Grating | LightSmyth | T-1850-800s Series | High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series |
Laser | Coherent | Custom made | Fidelity, HP |
λ/2 | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | Mounted superachromatic half-wave plate |
PBS | Thorlabs | CM5-PBS203/M | 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube, |
PMMA beads | Merck | MFCD00198073 | Micro particles based on polymethacrylate |
Prisms | Crisel | 320-8218 | LASER DISPERSING PRISMS in SF11 |
PS beads | Merck | 72986-10ML-F | Micro particles based on polystyrene |
YVO4 crystal | Dr. Sztatecsny GmbH | Custom made | thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm |