Multiplex Imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia

Summary

Apresentamos um protocolo para adquirir imagens químicas com microscopia de dispersão Raman estimulada por banda larga (SRS). Baseado em um microscópio SRS que opera com detecção diferencial de bloqueio multicanal, o protocolo descreve a preparação da amostra, o ajuste do aparelho SRS e a quimiometria para desembaraçar diferentes constituintes de amostras quimicamente heterogêneas.

Abstract

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica óptica não linear para imagens químicas sem rótulo. Esta ferramenta analítica fornece mapas químicos em alta velocidade, e alta resolução espacial de amostras finas, interrogando diretamente suas vibrações moleculares. Em sua implementação padrão, a microscopia SRS é banda estreita e forma imagens com apenas uma única frequência vibracional de cada vez. No entanto, essa abordagem não só dificulta a especificidade química do SRS, mas também negligencia a riqueza de informações codificadas dentro de espectros vibracionais.

Essas limitações podem ser superadas pela SRS banda larga, uma implementação capaz de extrair um espectro vibracional por pixel da imagem em paralelo. Isso fornece dados hiperespectrais que, quando associados à análise quimiotmétrica, maximizam a quantidade de informações recuperadas da amostra. Assim, a BANDA LARGA SRS melhora a especificidade química do sistema, permitindo a determinação quantitativa da concentração dos diferentes constituintes de uma amostra. Aqui, relatamos um protocolo para imagens químicas com microscopia SRS de banda larga, baseado em um microscópio SRS construído em casa operando com uma detecção personalizada de amplificador multicanal-lock-in diferencial. Discute a preparação da amostra, o alinhamento do aparelho SRS e a análise quimiotítrica. Ao adquirir espectros vibracionais de Raman, o protocolo ilustra como identificar diferentes espécies químicas dentro de uma mistura, determinando suas concentrações relativas.

Introduction

A microscopia de Raman é uma poderosa técnica de imagem que fornece mapas químicos ricos medindo Raman espalhando¹, um processo radiativo inelástico que se origina de moléculas vibrando em resposta à luz incidente ^2,3. Cada pixel de um mapa de Raman contém um espectro que carrega informações diretas sobre a composição química e estrutura da amostra, resultando em imagens com contraste vibracional intrínseco. Até o momento, a microscopia de Raman é o ponto de vista de referência para estudos de microspectroscopia de vibrações moleculares, pois nenhuma outra técnica de imagem pode produzir imagens com alta especificidade química e alta resolução espacial⁴. Apesar de sua excelente especificidade química, a eficiência de geração da dispersão de Raman é baixa, exigindo tempos de moradia de pixels estendidos ou excitação de alta potência, levando, respectivamente, a baixas taxas de aquisição e incompatibilidade com amostras sensíveis.

Essa única deficiência da microscopia de Raman levou os pesquisadores a aplicar raman coerentes espalhando 5,6,7,8,9 como fonte de contraste para microscopia. Trata-se de um processo óptico não linear que aumenta a resposta vibracional por várias (até sete) ordens de magnitude, permitindo assim imagens químicas de alta velocidade 10,11,12,13. Em particular, as duas técnicas de dispersão raman mais empregadas são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS)¹⁴ e estimuladas a dispersão de Raman (SRS)¹⁵. Em contraste com os CARS, o SRS mostra uma dependência linear da concentração de moléculas ressonantes. É imune ao fundo não ressonante, um efeito não linear não relacionado a qualquer transição vibracional, mas distorcido às formas lorentzianas características do espectro de Raman das vibrações moleculares^16,17. Assim, a microscopia SRS produz informações autênticas do Raman que permitem análise direta de imagem quantitativa.

SRS é um processo óptico de terceira ordem, não linear, que fornece informações diretas sobre as ligações químicas de uma amostra. Ela se origina da superposição espostetemporal de dois campos ópticos geralmente na região espectral quase infravermelha, ou seja, a bomba e os Stokes na frequência ω_pu e ω_S, respectivamente 10,11,18. Esta superposição gera uma batida na frequência bomba-Stokes desafinando Ω = ω_{pu-ω S}. Quando Ω corresponde a uma vibração molecular Ω_R, a molécula ressoa, causando uma transferência de energia coerente entre os campos de luz e a molécula. Como resultado, a molécula atinge um estado vibracionalmente animado. Esse processo pode ser monitorado medindo a aniquilação de fótons de bomba (um sinal conhecido como perda de Raman estimulada [SRL]) ou a amplificação concomitante dos fótons Stokes (um processo conhecido como ganho de Raman estimulado [SRG]). SRG e SRL são pequenos sinais (ΔI) que se sentam em cima de um fundo intenso e flutuante (I). Como os valores típicos do sinal SRS (ΔI/I) estão na faixa 10-6-10-4, o ruído laser pode facilmente obscurecê-lo. Para mitigar os efeitos prejudiciais do ruído laser na relação sinal-ruído (SNR) e, consequentemente, na velocidade de imagem, a detecção de SRS conta com técnicas de transferência de modulação (por exemplo, amplificadores de lock-in, circuitos ressonantes ou mediadores de box-car) em altas frequências de modulação (>1 MHz), onde o ruído laser atinge seus valores mínimos 15,19,20.

A microscopia srs convencional emprega a bomba narrowband (≈10 cm⁻¹) e os pulsos de Stokes para produzir imagens químicas em uma única frequência vibracional, permitindo imagens de taxa de vídeo com tempos de pixel tão baixos quanto ≈100 ns^21,22. No entanto, como a microscopia SRS da banda estreita forma mapas químicos escaneando sequencialmente a amostra em apenas algumas frequências vibracionais, suas informações são limitadas^{a 23}. Imagens srs com um ou dois contrastes vibracionais podem não ser suficientes para diferenciar espécies químicas com bandas Raman sobrepostas, especialmente dentro de sistemas heterogêneos. Portanto, o microscópio SRS de banda estreita paradigmática não explora todo o potencial do SRS, pois investigar um punhado de frequências vibracionais dificulta sua especificidade química e negligencia a riqueza de informações codificadas dentro de espectro vibracional. Além disso, a varredura sequencial da amostra em diferentes frequências resulta em tempos prolongados de habitação de pixels que podem desencadear fotodamagem e evitar um rigoroso coregissto espacial entre imagens consecutivas, levando a artefatos de movimento.

Ao contrário de sua contraparte de banda estreita, a microscopia SRS de banda larga recupera um espectro vibracional por pixel em cada amostra de varredura 10,12,24. Assim, a rede larga SRS fornece imagens hiperespectrais com estrita coregistração espacial de diferentes contrastes vibracionais, permitindo uma análise rigorosa dos dados. Isso não só revela os componentes químicos do espécime através do espectro de Raman, mas também ajuda a determinar suas concentrações relativas. Dependendo de como os espectros são adquiridos, a microscopia SRS de banda larga é classificada como SRS hiperespectral ou SRS multiplex. No SRS hiperespectral, o espectro SRS por ponto digitalizado da amostra é adquirido sequencialmente (ou seja, é recuperado varrendo a frequência de detuning Ω), construindo um espectro SRS empilhando os sinais SRS em turnos raman consecutivos. O espectro Raman é medido simultaneamente em vários modos vibracionais em SRS multiplex. Assim, a abordagem multiplex SRS combina um pulso de banda estreita modulada com um pulso de banda larga para conduzir o sinal SRS em diferentes frequências, e usa um detector multicanal com uma sensibilidade comparável à do SRS de banda estreita para detectar o espectro SRS.

Este artigo apresenta um protocolo para produzir mapas químicos de amostras heterogêneas usando microscopia multiplex SRS. Um esquema do microscópio SRS empregado neste protocolo é descrito na Figura 1 e descrito em detalhes em outros lugares 25,26,27. Resumidamente, um laser comercial de fibra Yb bloqueado pelo modo, produzindo pulsos de 140 fs centrados em 1040 nm, com potência média de 10 W e uma taxa de repetição de 80 MHz, impulsiona o microscópio SRS de banda larga. Um divisor de feixe polarizador (PBS) separa o feixe fundamental em dois ramos. Para produzir os pulsos de Stokes de banda estreita, um ramo com 4 W do feixe fundamental é enviado para um étalon que gera um feixe de banda estreita (≈15 ^cm-1), que é então modulado a 1,6 MHz com um modulador óptico acústico (AOM). A fração restante com 6 W do feixe fundamental é dobrada de frequência com um cristal de 2,8 mm de espessura de lítio triborate (LBO), cortado para correspondência de fase tipo I (φ = 90°, φ = 13,8°). A segunda geração harmônica resultante a 520 nm viaja para uma cavidade dobrada x para bombear um oscilador paramétrico óptico (OPO), um dispositivo que usa um cristal LBO de 3,0 mm de espessura (correspondência de fase tipo I, φ = 90°, φ = 9,8°) como meio ativo para fornecer uma radiação óptica de banda larga incapaz dentro da região espectral de 680-910 nm (Figura 2). Esses pulsos de banda larga servem como bomba nos experimentos srs e se propagam a um compressor prisma para précompensar os efeitos de dispersão induzidos pelo objetivo do microscópio.

Após o estágio de compressão, uma placa de onda λ/2, combinada com uma placa de birefringent YVO₄ , produz duas réplicas ortogonalmente polarizadas cuja subtração eletrônica no plano de detecção cancela o ruído da bomba de banda larga. Um espelho dicroico combina a bomba e os feixes de Stokes e os envia para um microscópio vertical. Um objetivo de imersão em água com uma abertura numérica (NA) de 1,27 concentra a luz na amostra, enquanto um objetivo de imersão em óleo com um NA de 1,4 a coleta. Antes do estágio de detecção, um filtro de passagem curta (SPF) remove os Stokes modulados, enquanto uma grade de difração operando na configuração Littrow dispersa a bomba de banda larga transmitida. Um segundo PBS₂ separa as réplicas da bomba, e uma lente as concentra em duas matrizes de fotodiodo. Os sinais dessas matrizes de fotodiodo são subtraídos eletronicamente e enviados para um amplificador multicanal-lock-in (M-LIA). O sinal desmodulado é então normalizado pelas leituras de corrente direta (DC) de uma das matrizes de fotodiodos, produzindo assim o espectro SRL.

Como um experimento exemplar, nós imagem misturas de vários dispersores raman bem conhecidos, cada um com um espectro raman único. Assim, o protocolo começa descrevendo como preparar as amostras de referência. À medida que detectamos o SRL, continuamos a explicar como obter pulsos de banda estreita Stokes e configurar a fonte óptica que fornece os pulsos da bomba de banda larga (≈ 250 ^cm-1), ou seja, o OPO construído em casa. O protocolo mostra o alinhamento e otimização dos feixes ópticos, descrevendo parâmetros críticos como a potência e os espectros da banda estreita Stokes e da bomba de banda larga. O protocolo descreve em detalhes o caminho óptico da bomba de banda larga porque requer elementos ópticos especiais. Também explica como encontrar a sobreposição espaçoetotemporal entre os pulsos de bomba-Stokes e mostra uma maneira prática de determinar o ruído de intensidade relativa (RIN), que por sua vez ajuda a definir a melhor frequência de modulação para experimentos de SRS. Em seguida, explicamos o princípio de trabalho e calibração da cadeia de detecção. Finalmente, o protocolo mostra o processo de aquisição de dados, quimiometria e pipeline de processamento de imagens.

Protocol

1. Preparação da amostra

NOTA: Este protocolo descreve a recuperação dos mapas de concentração e os espectros característicos de SRS de misturas quimicamente heterogêneas.

1. Para preparar a amostra, extraia 2 μL de uma suspensão aquosa de microescrilatos de methacrilato de polimetila (PMMA) (ver a Tabela dos Materiais) e despeje a fração de 2 μL em uma mancha de cobertura de microscópio.
   1. Com uma ponta de pipeta limpa, extraia 2 μL de uma suspensão aquosa de microesferas de poliestireno (PS) e combine-a com a suspensão pmma no deslizamento de tampas. Com uma ponta de pipeta, misture delicadamente a suspensão e deixe secar por 24 horas.
      NOTA: É importante combinar cuidadosamente a concentração das suspensões de microesferas para evitar quantidades desproporcionais das microesferas na superfície da amostra. O diâmetro das contas PS e PMMA são de 10 e 6 μm, respectivamente. Essas dimensões permitem demonstrar a alta resolução espacial do microscópio sem comprometer a eficiência de geração do SRS.
2. Em cima da camada plana e branca de contas que aparecerão quando a água sega, adicione 20 μL de sulfóxido de dimetil (DMSO) e, em seguida, 20 μL de azeite puro.
3. Aplique esmalte nas bordas de uma segunda mancha de microscópio. Coloque a mancha na mistura, com o esmalte virado para baixo, aplicando pressão suficiente para selá-la. Deixe secar.
   NOTA: A Figura 3 apresenta resultados exemplares obtidos com estas etapas. Se devidamente selado, esta amostra deve durar até três meses.

2. Otimização da bomba e dos feixes de Stokes

1. Ligue o laser e deixe-o alcançar o equilíbrio térmico. Aplique uma dispersão de atraso de grupo negativo (GDD) de GDD = -6.000 fs² ao feixe fundamental.
   NOTA: Este valor GDD é fundamental para conduzir com sucesso o OPO e é ideal para esta configuração, mas provavelmente variará em diferentes sistemas. GDD negativo pode ser introduzido através de pares de grade, compressores de prisma ou modeladores de pulso com base em moduladores de luz espacial²⁸.
2. Divida o laser fundamental com um feixe polarizador (PBS₁) em dois ramos. Para obter os pulsos de Stokes de banda estreita, guie um ramo com 4 W para um étalon. Gire ligeiramente o étalon até que uma linha espectral estreita seja obtida e centrada no pico do espectro de pulso (veja a curva vermelha na Figura 2).
   NOTA: Este etalon tem uma finesse eficaz de 29 e uma faixa espectral livre de 29,8 nm a 1.040 nm.
3. Para obter pulsos modulados de Stokes, envie o feixe de banda estreita para um modulador óptico acousto.
   NOTA: Como mostrado na Figura 4A, o feixe difrroso de primeira ordem experimenta 100% de modulação, enquanto a ordem zero apenas 50%. Portanto, é preferível empregar a primeira ordem para evitar iluminar a amostra com um feixe forte não-desmoulado que pode induzir fotodamagem amostral sem gerar qualquer sinal SRS.
   1. Para otimizar a eficiência da modulação, altere a distância entre as lentes f₁ e f₂ (Figura 4B). Meça o feixe modulado com um fotodiodo e regise seu perfil com um osciloscópio.
   2. Altere a distância entre f₁ e f₂ até que o contraste máximo seja alcançado entre a amplitude e a linha de base das leituras do osciloscópio.
      NOTA: Este par de lentes não funciona como um collimador, mas cria um ponto focal eficaz no cristal do AOM.
   3. Coloque uma terceira lente f₃ para afinar a cintura do feixe stokes, permitindo que o volume de interação no plano focal do microscópio seja alterado e, consequentemente, para otimizar o sinal SRS.
      NOTA: O feixe de Stokes foi modulado a 1,6 MHz neste protocolo.
4. Concentre os 6 W restantes da potência óptica do feixe fundamental em um cristal triborate de lítio (LBO) (LBO_1, φ = 90°, φ = 13,8°) para dobrar a frequência do feixe fundamental através da segunda geração harmônica (SHG) (Figura 5A).
   1. Para maximizar a eficiência do SHG, gire ligeiramente o cristal, variando o ângulo φ (Figura 5B). Otimize o LBO₁ para obter pelo menos 2,5 W de SHG.
5. Ajuste o ângulo φ do LBO₂ para maximizar a eficiência de geração do feixe de sinal.
   NOTA: As distâncias focais das lentes f₁, f₂ e f₃ foram cuidadosamente escolhidas para combinar o feixe SHG com a cavidade OPO. Assim, as distâncias focais dessas lentes variam em diferentes configurações. Devido à dispersão residual na cavidade OPO, uma pequena mudança no comprimento da cavidade induz uma mudança do espectro do feixe de sinal.
   1. Ajuste o comprimento da cavidade para obter um espectro de bomba que, juntamente com a banda estreita Stokes a 1.040 nm, pode produzir uma desintação de frequência dentro de 1.373-5.090 ^cm-1. Esta faixa cobre as vibrações na região espectral de alongamento do CH (2.800-3.050 ^cm-1). Veja o espectro azul na Figura 2.
6. Para compensar os efeitos de dispersão induzidos pelo objetivo do microscópio de excitação, envie a bomba de banda larga para um compressor prisma. Digite a bomba em prisma A através de seu ápice e guie a bomba dispersa em direção ao ápice do prisma B. Defina a quantidade de dispersão negativa necessária e, em seguida, ajuste a distância entre os apices L dos prismas em conformidade.
   NOTA: A Figura 6 mostra o arranjo dos prismas²⁹. Neste caso, a compensação foi fixada para GDD ≈ -12.800 fs²; daí L = 1,26 m.
   1. Use prismas cortados por Brewster.
      1. Certifique-se de que a polarização do feixe de bomba está dentro dos planos triangulares dos prismas (rostos não polidos de cima/inferior).
      2. Certifique-se de que o ângulo de incidência φ_no feixe da bomba corresponde ao ângulo Brewster.
      3. Certifique-se de que a face de saída do prisma A é paralela à face de entrada do prisma B.
   2. Para estimar o GDD do pulso de banda larga a ser compensado, meça o sinal SRS em um único comprimento de onda λ₁, registrando o atraso de tempo τ₁ entre pump-Stokes no qual o SRS máximo (λ₁) é obtido. Repita este procedimento para um segundo comprimento de onda λ₂, registrando novamente o atraso de tempo τ₂ em que o SRS(λ₂) foi máximo.
      NOTA: Como o GDD é definido como o derivado do atraso do grupo em relação à frequência angular, as medições acima mencionadas permitem a estimativa do GDD do feixe de banda larga (Eq [1]).
      (1)
7. Usando uma placa de onda λ/2, defina a polarização do feixe da bomba para 45°. Guie a bomba polarizada até uma placa YVO₄ com um comprimento de 13,3 mm, definindo o eixo rápido desta vertical de cristal birefringent.
   NOTA: Ao viajar pela placa YVO₄ , os pulsos da bomba serão divididos em duas réplicas ortogonalmente polarizadas propagando colli quase, mas mantendo um atraso Δt ≈ 10 ps entre eles. Este atraso é uma função da espessura e dos índices refratários do cristal birefringent. A partir de agora, as réplicas da bomba com o mesmo estado de polarização dos pulsos de Stokes serão chamadas de "sinal" enquanto aquelas com um estado ortogonal como "referência". Os detalhes desta técnica, chamada de detecção equilibrada inline, foram descritos anteriormente³⁰.
8. Combine a bomba e os feixes de Stokes com um espelhodicróico e alinhe-os cuidadosamente usando um par de pinros fluorescentes, garantindo que ambos se propagam quase. Atenuar os feixes e usar uma lente para focalizá-los em um fotodiodo rápido (pelo menos 100 MHz de largura de banda).
   1. Bloqueie a bomba e meça pulsos únicos de Stokes com um osciloscópio digital de alta largura de banda. Use o sinal de gatilho do laser como fonte do relógio para as medições do osciloscópio. Determine o valor médio no qual a tensão do fotodiodo atinge o máximo.
   2. Bloqueie o feixe de Stokes e repita este procedimento para os pulsos da bomba. Aumente ou reduza o caminho óptico do feixe da bomba (Stokes) até que seus pulsos cheguem aproximadamente ao mesmo tempo que os pulsos de Stokes (bomba).
      NOTA: Isso deve garantir uma precisão de alguns milímetros no máximo na correspondência da diferença óptica de caminho entre os dois braços.
   3. Remova o fotodiodo e coloque um cristal não linear com um ângulo de corte adequado para geração de frequência de soma (SFG) entre fótons pump-Stokes.
      NOTA: O cristal não linear utilizado aqui foi cortado para a correspondência de fases tipo I, φ = 90°, φ = 9,8°. O eixo óptico do cristal não linear deve ser paralelo à polarização dos Stokes e pulsos de sinal.
   4. Faça os feixes de bomba/Stokes ligeiramente não lineares e mova a linha de atraso até que o SFG, um sinal que, devido à correspondência de fase, esteja entre os SHGs da bomba e as vigas de Stokes. Se o sinal não for encontrado, verifique a sobreposição espacial dos dois feixes no cristal.
      NOTA: O SFG é de mudança azul e deve ser facilmente visível a olho nu.
   5. Em caso de dificuldades inesperadas, coloque um filtro de passagem baixa para remover a bomba e Stokes e seus respectivos SHGs e meça o SFG com um espectrômetro (Figura 7A). Encontre o atraso de tempo em que o SFG atinge sua intensidade máxima, um valor que determina a sobreposição espástica ideal necessária para a geração de sinal não linear, e fixe a linha de atraso lá (Figura 7B).
9. Meça os perfis do feixe com uma câmera calibrada. Alternativamente, use um cartão infravermelho e estime os diâmetros por olho. Use dois telescópios, um para a bomba e outro para o feixe stokes. Com esses telescópios, tente combinar os diâmetros do feixe com a abertura traseira do objetivo de excitação.
   NOTA: Este procedimento garantirá a resolução espacial máxima da configuração.
   1. Uma vez que o sinal SRS é obtido, use o telescópio no feixe da bomba para ajustar seu diâmetro, variando sua gama de Rayleigh e, consequentemente, o volume de interação no foco do microscópio. Pare quando o SRS máximo for alcançado.
10. Use um fotodiodo para medir a intensidade do feixe da bomba (Stokes) e, com a responsabilidade do fotodiodo, calcule a energia média que afeta a área ativa do detector.
    1. Se usar um fotodiodo de alta largura de banda, conecte um filtro eletrônico de baixo passe para obter apenas o componente constante ou DC. Para medir δP(f), conecte a saída de um fotodiodo de alta largura de banda (desconecte o filtro de passagem baixa) à entrada de um amplificador de travamento. Armazene a saída de bloqueio em diferentes frequências de desmodulação e use a responsabilidade do fotodiodo para converter de V para W.
       NOTA: Os amplificadores de travamento comercial possuem ferramentas incorporadas para medir δP(f) (por exemplo, instrumentos de Zurique incorporados ao LabOne a Frequency Sweeper³¹).
    2. Depois de medir o RIN dos feixes, desligue o laser e meça o ruído eletrônico (ou seja, o RIN calculado sem qualquer luz nos detectores).
       NOTA: Desde que o RIN seja limitado pelas flutuações do laser e não pelo ruído do tiro, esta medição escura ajudará a diagnosticar a instrumentação empregada para as medições; se o ruído eletrônico for tão alto quanto o RIN do laser, este não pode ser usado para medir o RIN do laser; amplificadores ultralow-noise podem ter que ser usados para reduzir o ruído eletrônico.
    3. Se o RIN for limitado pelo ruído de tiro e não pela flutuação do laser, brilhe mais energia óptica no detector. Veja a Figura 8.

3. Configuração da detecção espectral para imagens SRS

1. Guie a bomba e os feixes de Stokes até o microscópio.
2. Coloque a amostra discutida na seção 1 e encontre uma região sem contas para ajudar a alinhar o feixe da bomba. Usando uma câmera, meça o perfil refletido do feixe Stokes (bomba) enquanto bloqueia a bomba (Stokes). Ajuste as posições dos pontos laser com os espelhos logo antes do microscópio.
   NOTA: Para obter a maior geração de SRS, eles devem se sobrepor perfeitamente. A Figura 9 mostra (A) a bomba, (B) Stokes e (C) ambos os feixes perfeitamente sobrepostos no plano focal do microscópio.
3. Faça com que os objetivos de excitação e coleta confocalem.
   NOTA: O uso de objetivos corrigidos pelo infinito significa que o foco da bomba no plano amostral resultará em um feixe colidido na abertura traseira do objetivo de coleta.
   1. Coloque um filtro de passagem curta para remover os Stokes modulados e guie o feixe da bomba até a grade. Coloque uma lente após a grade para concentrar o feixe disperso nos detectores.
      NOTA: A equação de grade ajudará a determinar a dispersão linear (ou seja, quantos nm por mm no plano do detector com uma lente de uma determinada distância focal f³²). A equação de grade relaciona a periodicidade de ranhura d da grade, o ângulo de incidência α, o ângulo de difração β, o comprimento de onda difracionado λ e a ordem de difração m (Eq [2]).
      (2)
4. Para detecção equilibrada, meça o espectro da referência e as réplicas de sinal que se propagam ao longo do feixe da bomba.
   NOTA: O perfil espacial do feixe da bomba após a grade é uma linha que compreende os diferentes componentes espectrais da bomba de banda larga ao longo de seu comprimento. Cada componente espectral da linha de bomba será focado à distância f por uma lente esférica (ver passos 3.1-3.2).
   1. Para evitar o corte da bomba dispersa, coloque a lente esférica o mais perto possível da grade. Coloque um PBS logo após a lente esférica para separar as réplicas da bomba.
      NOTA: Aqui, um divisor de feixe de cubo polarizador foi usado porque esse tipo de polarizador não embaralha a polarização do feixe da bomba. Ele também separa efetivamente as diferentes réplicas da bomba e pode ser grande o suficiente para evitar o corte da bomba de banda larga. O PBS refletirá a réplica de sinal (s-polarizado) e transmitirá a réplica de referência (p-polarizada).
   2. Com um par de espelhos de direção, guie o sinal e faça referência aos seus respectivos detectores (Figura 1).
      NOTA: Na configuração balanceada ideal, as réplicas de sinal e referência devem ter a mesma potência óptica.
   3. Para remover o ruído no feixe da bomba, correlacionar os canais da matriz de fotodiodos que medem o sinal com suas contrapartes no detector de referência. Assim, certifique-se de que o fotodiodo n^th dos conjuntos de sinal e fotodiodo de referência mede a potência óptica do mesmo componente espectral das réplicas de sinal e referência.
      NOTA: A Figura 8 mostra espectros rin exemplares.
5. Para garantir a correspondência espectral entre as duas matrizes de fotodiodo, coloque uma pequena fenda ou uma íris entre a grade e o PBS para filtrar espacialmente a bomba dispersa. Corte todos, exceto um componente espectral das réplicas da bomba para centralizar os raios transmitidos no detector n^th das matrizes de referência e fotodiodo de sinal. Use os espelhos de direção mencionados para ajustar a correlação dos diferentes canais de detecção.
6. Neste ponto, inicie a microscopia SRS. Para isso, modular o Stokes, raster-scan a amostra, e adquirir a transferência de modulação no espectro da bomba (ΔI) com seu espectro DC correspondente (I) para obter o espectro SRS normalizado (ΔI/I) de cada pixel. Produzir matrizes tridimensionais cujas linhas (x) e colunas (y) contêm as posições digitalizadas da amostra. Em cada vetor (z) ortogonal para o plano x-y, armazene um espectro SRS.
   NOTA: A Figura 12 mostra a estrutura dos dados hiperespectrais srs.
   1. Defina a potência do feixe stokes para 65 mW e a do feixe da bomba de banda larga para 20 mW. Estabeleça um tempo ideal de integração para os experimentos.
      NOTA: Aqui, o tempo de integração foi de 44 μs; no entanto, o tempo de moradia do pixel foi de 1 ms devido ao lento scanner piezo.

4. Quimiometria de dados de SRS hiperespectral

1. Use a análise de resolução de curvas multivariada para desembaraçar os diferentes componentes químicos da amostra. Baixe a GUI no link em Tauler, de Juan e Jaumot³³.
   NOTA: Aqui, foi utilizado o programa MATLAB multivariado de resolução de curvas alternadas (MCR-ALS) desenvolvido pela Tauler e colegas de trabalho ^34,35. Para aplicações de MCR-ALS aos dados da SRS, consulte ^36,37; para discussões detalhadas sobre o algoritmo, consulte ³⁸.
2. No MATLAB, remodele o cubo de dados hiperespectrais SRS em uma matriz D com suas linhas contendo o espectro SRS. Suponha que o hipercubo SRL D desdobrado é uma combinação linear da concentração C e dos perfis espectrais S dos componentes químicos da amostra (i.e., D = CS ^T + E, onde E é uma matriz que contém o erro experimental, e o superscript ^T indica transposição matricial).
3. Obtenha os principais componentes dos dados para separar C e S. Como é conhecido a priori que a amostra discutida na seção 1 contém quatro espécies, ou seja, DMSO, Azeite de Oliva, PMMA e PS, configuram o programa para procurar quatro espécies mais outra para explicar o ruído de fundo. Se houver uma amostra diferente com um número maior ou menor de espécies, configure o programa em conformidade.
   NOTA: O programa faz uma decomposição de valor singular dos dados espectrais, usando-os como os palpites iniciais do espectro puro S.
   1. Alternativamente, alimentar o programa com uma matriz contendo os conhecidos traços espectrais (por exemplo, o espectro espontâneo de Raman das substâncias).
      NOTA: Utilizando as estimativas iniciais do espectro puro, o programa calculará C = DS(^S)−1 e S^T = (C^TC)⁻¹C TD. Os novos valores de C e S são otimizados com um algoritmo alternado de menos quadrados.
4. Como o SRS é um sinal não inativo, constrange o algoritmo alternado de menos quadrados para fornecer apenas valores positivos.
   NOTA: O C e S otimizados permitirá a construção de uma nova matriz D*= CS^T, um conjunto de dados que o programa irá comparar com os dados originais D. O programa itera automaticamente essas etapas até que a diferença entre D* e D seja menor do que um valor de limiar arbitrário que pode ser definido.
5. Lote C e S para adquirir imagens químicas e os espectros característicos dos componentes químicos da amostra.

Results

A Figura 3 mostra resultados exemplares obtidos utilizando este protocolo com PS, PMMA e azeite de oliva. Esta rotação de LBO₁ mudará o índice de refração experimentado pelo campo SHG, modificando diretamente sua velocidade de fase. Quando a velocidade de fase do campo SHG corresponde à da polarização não linear induzida no LBO₁, o campo não gerado e a polarização não linear estarão em fase, levando à intensa radiação SHG. Em outras palavras, ajustar o ângulo φ do LBO₁ permitirá que o usuário atinja a condição ideal de correspondência de fase para SHG. Como um cristal de correspondência de fase tipo I é usado aqui, a polarização do feixe SHG será ortogonal à do feixe fundamental (Figura 5B).

A Figura 8 mostra o RIN das fontes ópticas usadas neste protocolo e o limite de ruído de tiro, que é uma consequência da natureza quântica de elétrons e fótons que estabelece um limite fundamental para o ruído laser. O RIN limitado de ruído de tiro é computado com o mostrado por Eq (3).

(3)

Onde h é constante de Planck, e não é a frequência óptica. Assim, o ruído de tiro fornece diretrizes úteis para o design eletrônico.

As figuras 11A e Figura 11C mostram dados exemplares de espectros equilibrados e desequilibrados. Naturalmente, os efeitos da detecção equilibrada impactam os resultados finais dos experimentos, ou seja, os mapas químicos. As figuras 11B e Figura 11D mostram imagens compostas nas condições desequilibrada e equilibrada, respectivamente. A implementação com sucesso do protocolo descrito ajudará a identificar e localizar os diferentes componentes químicos de uma amostra heterogênea e extrair seus espectros característicos de SRS. Submeter os dados hiperespectrais da Figura 12 à análise quimiotítrica dá a Figura 13. A Figura 13A mostra um composto dos mapas de concentração dos diferentes componentes químicos da amostra, enquanto a Figura 13B mostra seus espectros característicos de SRS. Observe que os dados mostrados na Figura 13A não só permitem que o usuário identifique facilmente os diferentes constituintes da amostra, mas também realize uma análise mais quantitativa. Por exemplo, usando os mapas de concentração, pudemos calcular a média da concentração fracionária de cada espécie química: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS e 22% azeite de oliva.

Figura 1: Esquema do microscópio DE BANDA LARGA SRS empregado neste protocolo. Abreviaturas: PBSx = feixe polarizador; SHG = segundo módulo de geração harmônica; OPO = oscilador paramétrico óptico; AOM = modulador óptico acousto; FPS = filtro de passagem curta; M-LIA: Amplificador de travamento multicanal; DM = espelho dicrómico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Espectros da bomba de banda larga tunable (azul) e dos feixes de Stokes de banda estreita (vermelho).

Figura 3: Imagem brightfield da amostra quimicamente heterogênea. Note que a microscopia convencional não permite que os diferentes constituintes sejam distinguidos. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: PS = poliestireno; PMMA = metacrilato de polimetila; DMSO = sulfoxida de dimetil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Modulação da banda estreita Stokes pulsa. (A) O traço azul transparente mostra o feixe 0^difrracado , enquanto o preto mostra a^1ª ordem correspondente. (B) Configuração óptica para otimizar a eficiência de modulação do feixe difrroso de^1ª ordem e ajuste fino do tamanho do feixe de Stokes antes de chegar ao objetivo de excitação. Abreviaturas: AOM = modulador óptico acousto; f_x = distância focal da lente X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Processos ópticos não lineares necessários para conduzir a Geometria OPO. (A) da interação SHG. Dois fótons fundamentais em ω₁ levam o sistema material a um nível virtual de alta energia, de onde o sistema de material salta para o estado terrestre, emitindo um fóton a ω_SHG. (B) Esquema do experimento SHG. (C) Um esquema das configurações SHG e OPO. (D) Geometria da interação DFG. Um fóton_SHG ω é dividido em fótons de sinal (_{sinal ω)} e fótons odler (ω_Idler). Um ganho do feixe de sinal é obtido alimentando os fótons de sinal e fazendo-os ressoar na cavidade. (E) Esquema do experimento DFG. Abreviaturas: SM_x = espelho esférico (R = 75 mm); OPO = oscilador paramétrico óptico; SHG = segundo módulo de geração harmônica; DFG = geração de frequência de diferença; LBO = triborate de lítio; OC = condensador de óleo; DM = espelho dicrómico; f_x = distância focal da lente X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Geometria do compressor prisma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Geração de frequência de soma para otimizar a sobreposição espostetemporal. (A) SFG entre a bomba e Stokes e seus respectivos SHG impinging em uma tela. Aqui, uma lente concentrou a bomba e os feixes stokes no cristal, enquanto um filtro de baixa passagem os removeu. (B) Intensidade do SFG entre a bomba e Stokes em função do atraso de tempo. Defina o tempo zero da configuração SRS na posição que maximiza o SFG. A assimetria da correlação cruzada em B é devido ao perfil temporal causado pelo etalon no feixe de Stokes. Abreviaturas: SFG = geração de frequência de soma; SHG = segundo módulo de geração harmônica; SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Espectro rin. A banda destacada em verde mostra a melhor região espectral para os experimentos srs. Modular o feixe de Stokes em qualquer frequência dentro desta banda garante que os efeitos do ruído laser no sinal SRS serão os mais baixos possíveis. Abreviaturas: RIN = ruído de intensidade relativa; SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Perfis de feixe. (A) Bomba, (B) Stokes, e (C) bomba e Stokes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Geometria presumida para uma grade de dispersão e um detector de matriz de fotodiodo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11. Os efeitos da detecção equilibrada. Efeitos em espectros (A, C) e imagens químicas (B, D). Os compósitos mostrados nos painéis (B) e (D) são os resultados finais dos experimentos (ou seja, após a análise quimiotmétrica dos dados hiperespectrais. Consulte a seção de protocolo 4 para obter detalhes). Barras de escala = 10 μm. Abreviação: SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Um hipercubo SRS representativo adquirido com microscopia SRS de banda larga. O avião x-y armazena as coordenadas das posições digitalizadas, enquanto cada vetor ao longo de z registra um espectro SRS. Abreviação: SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Análise quimiotmétrica dos dados hiperespectrais de SRS. (A) Composto dos mapas de concentração dos diferentes constituintes da amostra. (B) Espectros característicos da espécie química. Em ambos os painéis, amarelo: azeite de oliva, azul: DMSO, ciano: PS e laranja: PMMA. Barra de escala = 20 μm (A). Abreviaturas: SRS = espectroscopia de dispersão de Raman estimulada; PS = poliestireno; PMMA = metacrilato de polimetila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A microscopia de BANDA LARGA SRS é uma poderosa técnica de imagem que oferece contraste químico autêntico para identificar e desembaraçar os componentes químicos de uma amostra heterogênea. O potencial dessa ferramenta analítica pode ser benéfico para diversos campos de pesquisa, desde a ciência dos materiais até a histopatologia. A desvantagem da microscopia de BANDA LARGA SRS é o fato de que ela é tecnicamente exigente; o experimentalista não só requer know-how sobre fontes de laser de banda larga, mas também precisa manipular os pulsos de laser para gerar com eficiência o SRS, um sinal que, por sua vez, precisa ser medido com sofisticados esquemas de detecção. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um fluxo de trabalho para produzir mapas químicos de compostos químicos mistos usando um microscópio SRS de banda larga multiplex. Embora o trabalho descrito possa ser trivial para alguns físicos a laser e microscopistas não lineares, pode não ser o caso dos leitores interessados nos benefícios da microscopia de SRS de banda larga cujo conhecimento científico reside fora desses domínios. Por isso, buscamos detalhar cada passo para orientar o grande público interessado na microscopia de SRS de banda larga.

O protocolo em questão começou mostrando como preparar uma amostra simples, mas espectroscopicamente rica, composta por vários dispersores raman fortes e conhecidos. Discutimos como obter a bomba de banda larga e os feixes de stokes de banda estreita necessários para configurar um microscópio SRS. A Figura 5C mostra um esquema das configurações SHG e OPO. Observe que a lente f₁ concentra o feixe fundamental no LBO₁ para gerar o SHG, enquanto um espelho dicroico reflete a radiação SHG e transmite o feixe fundamental residual. Uma segunda lente f₂ collima o feixe SHG. Como f₂ > f₁, o feixe SHG é expandido por um fator igual a f₂/f₁. Uma terceira lente f₃ concentra o feixe SHG expandido em um segundo cristal LBO tipo I (LBO₂) cortado a φ = 90° e φ = 29,0°. Ao bombear LBO₂ com o supracitado SGH (520 nm), a radiação dentro da faixa de 680-910 nm emergirá de LBO₂ até a geração de frequência de diferença (DFG), produzindo dois feixes: o sinal e o o ocler²⁷ (Figura 5D,E). Este último é descartado enquanto o primeiro é amplificado na cavidade OPO para fornecer os pulsos da bomba empregados nos experimentos srs. A bomba do OPO a 520 nm, ou seja, o feixe SHG, não deve ser confundida com a bomba dos experimentos SRS (ou seja, o feixe de sinal do OPO).

O contraste na microscopia SRS origina-se de um sinal não linear gerado no ponto focal do microscópio, um sinal que exige confinar um grande número de fótons no plano amostral em um determinado momento. Este confinamento de fótons é alcançado com um objetivo de microscópio de alta abertura numérica (NA), uma matriz de lentes que também define a resolução espacial do sistema: quanto maior a NA, maior a resolução espacial. No entanto, os objetivos de NA elevados são densamente embalados com vidro, o que introduz GDD positivo à radiação pulsada, um chirp de frequência que, em última análise, amplia o perfil temporal dos pulsos³⁹. Assim, o GDD introduzido pelo objetivo do microscópio pode aumentar a duração dos pulsos da bomba de banda larga, tornando-o ainda mais longo do que o envelope temporal de Stokes e reduzindo a largura de banda eficaz e acessível do sinal Raman. Além disso, essa ampliação também pode introduzir uma distorção do perfil espectral do espectro SRS medido.

Em CARS, o sinal espectroscopicamente relevante emerge em comprimentos de onda que diferem dos dos campos de excitação. Um simples tubo fotomultiplier ou câmera ccd (dispositivo acoplado por carga) pode ser usado para integrar o sinal CARS a tempo, somando milhares de pulsos para obter a média do ruído do laser. Em vez disso, o sinal SRS aparece como uma transferência de modulação fraca incorporada dentro de um fundo laser forte e flutuante. Como essa modulação é fraca, o ruído do laser pode facilmente sobrecarregá-lo, reduzindo tanto a velocidade de imagem quanto a sensibilidade do microscópio SRS. Portanto, antes da imagem, é imprescindível medir o ruído de intensidade relativa (RIN) para determinar se o laser é adequado para imagens de SRS de alta velocidade e selecionar a frequência de modulação com o menor ruído. O RIN é definido como a densidade espectral de potência sonora [δP(f), com unidades W²/Hz] do laser normalizado pela potência óptica média ()^40,41. Em outras palavras, o RIN descreve as flutuações do laser normalizadas em diferentes frequências (Eq [4]).

(4)

Assim, o RIN é um parâmetro do sistema SRS que determina a faixa de frequência de modulação ideal para os experimentos. Por exemplo, a barra de azeitona na Figura 8 mostra a faixa de frequência de modulação ideal para imagens SRS. No caso de SRS de banda estreita, o usuário deve medir o RIN tanto da bomba quanto do Stokes para escolher qual feixe precisa ser modulado para alcançar o desempenho ideal. Nota da Figura 8, por exemplo, que o feixe de Stokes tem um RIN ligeiramente maior do que a bomba, implicando que as medidas SRG ficariam mais ruivas do que suas contrapartes SRL. No caso da SRS de banda larga, o feixe que deve ser modulado é o feixe de banda estreita.

A dispersão angular D da grade expressa o ângulo de difração em função do comprimento de onda, e é definida como a derivada da equação de grade. Para a configuração Littrow, a dispersão angular é dada por Eq (5).

(5)

Para obter Eq (5), assumimos α = β, resolvemos Eq (2) para m/d e inserimos o resultado em dβ/ dλ. Observe que na configuração Littrow, β = ^sin-1(mλ/2d). Dentro da aproximação de ângulo pequeno, a mudança de posição ao longo do espectro é fdβ ≈ dl (Figura 10). Assim, inserindo dβ em Eq (5), podemos calcular a dispersão linear, uma quantidade com unidades de nm ^mm-1 utilizando Eq (6):

(6)

Para uma grade de difração operando na configuração Littrow com 1.851,85 ranhuras/mm, d = 540 nm. Se usarmos a difração de primeira ordem de luz a ~789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Com uma lente f = 750 mm, temos uma dispersão linear de ≈ 0,5 nm ^mm-1, traduzindo em ≈ 7,8 ^{cm-1 mm-1}. Assim, a distância focal da lente determina a "densidade" de nm por mm no plano detector: Quanto maior a distância focal, menor a distância por mm obtida, aumentando o espaço entre as linhas espectrais da bomba de banda larga. Por outro lado, com distâncias focais mais curtas, haverá mais nm por mm no plano detector, reduzindo o espaço ocupado pela bomba dispersa.

A detecção equilibrada melhora a qualidade da imagem e a sensibilidade das configurações ruivas. Por exemplo, de acordo com o espectro rin mostrado na Figura 8 e considerando o SRS típico com uma amplitude de 1 x 10-5, a relação sinal-ruído desequilibrada (SNR) é ≈60. Usando detecção equilibrada (ou seja, perto do ruído de tiro), é possível alcançar um SNR de ≈145. A Figura 11 mostra espectros e imagens compostas em condições equilibradas e desequilibrados. Naturalmente, os efeitos da detecção equilibrada impactam os resultados finais dos experimentos, ou seja, os mapas químicos. Apoiados por esses resultados, enfatizamos que a detecção equilibrada é uma técnica poderosa para combater os efeitos prejudiciais das flutuações do laser na qualidade da imagem. Vale ressaltar que a detecção equilibrada é mais adequada para lasers barulhentos, como osciladores de fibra. Microscópios SRS operando com fontes de luz óptica silenciosas (por exemplo, lasers de estado sólido), podem não exigir detecção equilibrada.

O protocolo também explica uma abordagem baseada na óptica não linear para encontrar a sobreposição espostetorial entre os pulsos desses feixes. Descrevemos as vantagens de usar o 1^em vez da^0ª ordem de difração de um AOM como o feixe de Stokes modulado. Além disso, os efeitos prejudiciais da dispersão sobre a eficiência de geração srs foram descritos com sugestões de maneiras de mitiga-los através de um compressor prisma. Além disso, o protocolo explica como alinhar os prismas e destaca três aspectos críticos a serem considerados para o melhor desempenho. Não apenas discutimos a relevância do RIN para microscopia SRS, mas também mostramos como medi-lo com um amplificador lock-in e, com o espectro RIN, definir a melhor frequência de modulação. Com um exemplo concreto, este artigo explica como a equação de grade ajuda na concepção da cadeia de detecção. Por fim, o protocolo ilustra, com dados reais da SRS, a estrutura do hipercubo SRS e como analisá-lo com uma linguagem de programação científica convencionalmente utilizada.

Este protocolo tem três pequenas limitações. Em primeiro lugar, o esquema de detecção empregado nesta contribuição consiste em um detector de bloqueio multicanal não conventídeo projetado e construído internamente por Sciortino et ^al.26 Como demonstrado anteriormente²⁵, este detector pode ser substituído por um fotodiodo balanceado fora da prateleira. Embora essa modificação diz respeito apenas ao detector e deixe o protocolo praticamente inalterado, com um fotodiodo único, é preciso escanear cada componente espectral no detector em vez de medi-los todos de uma vez. Em segundo lugar, este protocolo emprega detecção equilibrada inline, que requer a inserção de vários elementos ópticos no caminho do feixe. Esses elementos ópticos aumentam a complexidade do sistema e levam a perdas de energia óptica e ampliação de pulso.

A detecção equilibrada inline também exige que as duas réplicas da bomba passem pela amostra, situação que pode não ser ideal para amostras sensíveis à luz, como células vivas, ou para as que as duas réplicas da bomba podem experimentar diferentes propriedades ópticas, cancelando assim a detecção equilibrada. Em terceiro lugar, o protocolo conta com um OPO construído em casa, um dispositivo que pode não estar prontamente disponível. No entanto, as alternativas aos espectros de banda larga entregues pelo OPO são o supercontinua de fibras ópticas não lineares ou cristais a granel. Este último só poderia ser empregado com lasers de baixa taxa de repetição (até 5 MHz). Assim, como em todo projeto experimental, o protocolo em questão tem algumas limitações. No entanto, são mínimos e não comprometem o sucesso dessa abordagem.

Embora uma amostra de referência seja descrita aqui, este protocolo pode desembaraçar com sucesso espécies químicas dentro de células e tecidos animais e vegetais, como celulose, espécies lipídicas ou proteínas, encontrando aplicações práticas em diferentes missões bioquímicas ou como uma ferramenta de diagnóstico na histopatologia. Da mesma forma, este protocolo pode ser uma ferramenta valiosa em ciências materiais. Por exemplo, seguindo este protocolo, pode-se interrogar a composição molecular e concentração das espécies poliméricas⁴². Além disso, essa metodologia é compatível com outras técnicas de microscopia não linear, como microscopia de banda larga baseada na sonda de bomba⁴³ e heterodyne CARS⁴⁴, processos de mistura de quatro ondas que, como acontece com o SRS, também requerem dois feixes de luz de excitação e medições de transferência de modulação. Finalmente, algumas das informações contidas neste artigo podem ser aplicadas a técnicas de imagem não lineares que não dependem de técnicas de transferência de modulação, mas requerem o alinhamento de dois ou mais raios laser pulsados, como as microscopias convencionais CARS⁴⁵ e SFG⁴⁶.

Em resumo, este protocolo descreve uma metodologia poderosa baseada na microscopia SRS de banda larga para extrair mapas químicos e seus espectros característicos de SRS de misturas quimicamente heterogêneas, fornecendo conjuntos de dados que permitem a análise quantitativa direta dos dados. A versatilidade e simplicidade do método também dão ao leitor interessado a possibilidade de adaptá-lo a diferentes técnicas não lineares.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Objetivo de coleta	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Óleo, NA=1.4,	Nikon Objetivo de imersão em óleo
Lamínulas	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartzo, lamínula para lâmina de microscópio, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Linha de atraso	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Estágio de microtradução de precisão, faixa de deslocamento de 150 mm
DMSO	Merck	D8418-500ML	Metilsulfinilmetano, Grau de Biologia Molecular DMSO, DMSO, Metilsulfóxido
Etalon	SLS Optics Ltd	feito sob medida	a 1.040 nm, montado em uma célula de aço inoxidável de 38 mm de diâmetro x 35,5 mm de comprimento com tampas protetoras contra poeira e um diâmetro de 50 mm ' apertar' anel de montagem
Objetivo de excitação	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Objetivo de imersão em água
Grade de	Grade LightSmyth	T-1850-800s Series	Alta Eficiência Grade de Transmissão Série T-1850-800s
Laser	Coerente	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Montado superacromático placa de meia onda
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
contas de PMMA	Merck	MFCD00198073	Micropartículas à base de prismas de polimetacrilato
	Crisel	320-8218	PRISMAS DE DISPERSÃO A LASER em contas SF11
PS	Merck	72986-10ML-F	Micropartículas à base de poliestireno
Cristal YVO4	Dr. Sztatecsny GmbH	Feito sob medida	espessura 8 mm, diâmetro 1,00 cm, 1 689,00 689,00 adequado para montagem de 1", revestido para 850 - 1.100 nm