Wistarアルビノラットにおける大腿骨骨切り術モデルを開発するためのプロトコル
Summary
ここでは、Wistarアルビノラットの大腿骨のシャフトを医原性的に破壊し、カルスの発達を追跡するためのプロトコルを提示します。この大腿骨骨切り術モデルは、研究者が骨折治癒のプロセスを評価し、薬物が骨折治癒にどのように影響するかを研究するのに役立ちます。
Abstract
骨折治癒は、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用によって骨欠損の再生をもたらす生理学的プロセスです。オステオアナボリック薬は骨折の修復を強化する可能性がありますが、高コストや望ましくない副作用などの制約があります。薬物の骨治癒の可能性は、最初はin vitro 研究によって決定することができますが、最終的な概念実証には in vivo 研究が必要です。私たちの目的は、研究者が大腿骨のシャフトの骨折後のカルス形成の発達を理解するのに役立ち、潜在的な薬物が骨治癒特性を持っているかどうかを確認するのに役立つ大腿骨骨切り術げっ歯類モデルを開発することでした。成体のオスのWistarアルビノラットは、施設動物倫理委員会の認可後に使用されました。げっ歯類は麻酔をかけ、無菌条件下では、大腿骨のシャフトの中央3分の1で完全な横骨折が開いた骨切り術を使用して作成されました。骨折は髄内Kワイヤーを使用して縮小および内部固定され、二次骨折治癒が行われました。手術後、腹腔内鎮痛薬と抗生物質を5日間投与しました。連続した毎週のX線はカルス形成を評価した。放射線学的に事前に決定された時点に基づいてラットを屠殺し、骨折カルスの発達を放射線学的および免疫組織化学を用いて分析した。
Introduction
骨は、骨形成細胞である骨芽細胞と骨吸収細胞である破骨細胞からなる密な結合組織です。骨折治癒は、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用によって骨欠損の再生をもたらす生理学的プロセスである1。骨折がある場合、骨折部位の骨芽細胞および破骨細胞の活動は、骨治癒を決定する重要な要素のいくつかです2。骨折治癒が通常の経過から逸脱すると、結合の遅延、不和合、または非癒合が発生します。骨折は、骨折の癒合が9か月間失敗し、過去3か月間修復が進行しない場合、非癒合状態にあると言われます3。すべての骨折の約10%〜15%は、非癒合4に進行する可能性のある修復の遅延を経験します。すべての骨折の非癒合率は5%〜10%であり、関与する骨と骨折部位によって異なります5。
骨折非癒合の治療のための現在のレジメンは、外科的および/または医学的モダリティで構成されています。現在、骨折の遅延または非癒合は、骨移植などの外科的戦略によって克服することができます。ただし、骨移植には、移植組織の利用可能性、ドナー部位の痛み、罹患率、感染などの制限と合併症があります6。治療には、骨形成タンパク質(BMP)やテリパラチド(パラトホルモン類似体)などの骨同化薬が含まれます。現在使用されている骨同化剤は、骨折の修復を強化する可能性がありますが、法外なコストや望ましくない副作用などの制約があります7。したがって、骨治癒のための費用効果の高い非外科的代替案を特定する余地があります。薬物の骨治癒の可能性は、最初はin vitro 研究によって決定することができますが、最終的な概念実証には in vivo 研究が必要です。骨治癒を促進することが知られている薬物は in vitro で評価する必要があり、有望であることが判明した場合は、 in vivo 動物モデル研究に使用できます。薬物が in vivo モデルで骨形成とリモデリングを促進することが証明された場合、次の段階(すなわち、臨床試験)に進む可能性があります。
動物の骨折治癒を評価することは、ヒト試験を受ける前に骨治癒のために導入された新しい薬剤を評価するための論理的な前進です。骨折治癒の in vivo 動物モデル研究のために、げっ歯類はますます人気のあるモデル8になりました。げっ歯類モデルは、運用コストが低く、スペースの必要性が限られており、骨の治癒に必要な時間が短いため、関心が高まっています9。さらに、げっ歯類は広範囲の抗体と遺伝子標的を持っているため、骨の治癒と再生の分子メカニズムに関する研究が可能になります10。コンセンサス会議では、さまざまな小動物の骨治癒モデルを包括的に強調し、骨の治癒に影響を与えるさまざまなパラメーターに焦点を当て、いくつかの小動物の骨折モデルとインプラントを強調しました11。
基本的な破壊モデルは、開モデルと閉モデルに大きく分けることができます。閉鎖骨折モデルは、骨に3点または4点の曲げ力を使用し、従来の外科的アプローチを必要としません。それらは、ヒトの長骨骨折に似た斜めまたはらせん状の骨折を引き起こしますが、骨折の位置と寸法の標準化の欠如は、それらの交絡因子として機能する可能性があります12。開放骨折モデルは、骨の骨切り術のための外科的アクセスを必要とし、骨折部位においてより一貫した骨折パターンを達成するのを助けるが、閉鎖モデル13と比較して治癒の遅延と関連している。骨折治癒を研究するために使用される骨の選択は、それらの寸法とアクセシビリティのために、主に脛骨と大腿骨のままです。骨折部位の選択は通常、骨幹または骨幹です。骨端領域は、骨粗鬆症の影響を受けやすいため、骨粗鬆症の被験者で骨折治癒が研究されている場合に特別に選択されます14。髄内ピンや外部固定具などのいくつかのインプラントを使用して、骨折を安定させることができます11,15。
この研究の目的は、研究者が大腿骨骨折後のカルスの発達を理解するのに役立つだけでなく、潜在的な薬物が骨治癒特性を持っているかどうかを判断するのに役立つ、シンプルでわかりやすいげっ歯類モデルを開発することでしたそれが作用するメカニズムを理解することによって。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、Wistarアルビノラットの骨折骨切りモデルを開発するために必要な詳細を明確に説明しています。このモデルは、骨折治癒における有望な骨同化薬の骨形成効果を評価し、骨治癒の複雑さを理解するために使用できます。この方法の顕著な特徴は、それが単純であり、あまり多くの時間や洗練された機器を必要としないことです。この方法では、成体の雄のWistarアルビノラットを?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、研究資金を提供してくれたAYUSH省のホメオパシー研究中央評議会(CCRH)に感謝したい。著者らは、ニューデリーのAIIMSの中央動物施設の支援と支援、およびニューデリーのAIIMSのCMETの写真とビデオ撮影の支援と支援に感謝しています。
Materials
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
Referências
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