I denne undersøgelse giver vi en detaljeret teknik til et simpelt, men robust kortikalt organoidkultursystem ved hjælp af standard feederfrie hPSC-kulturer. Dette er en hurtig, effektiv og reproducerbar protokol til generering af organoider, der modellerer aspekter af hjerneældning in vitro.
Hjerneorganoider er tredimensionelle modeller af den udviklende menneskelige hjerne og giver en overbevisende, banebrydende platform til sygdomsmodellering og storstilet genomisk og lægemiddelscreening. På grund af den selvorganiserende karakter af celler i hjerneorganoider og det voksende udvalg af tilgængelige protokoller til deres generation er der identificeret problemer med heterogenitet og variabilitet mellem organoider. I dette protokolpapir beskriver vi en robust og replikerbar protokol, der stort set overvinder disse problemer og genererer kortikale organoider fra neuroektodermale forfædre inden for 1 måned, og som kan opretholdes i mere end 1 år. Denne meget reproducerbare protokol kan let udføres i et standard vævskulturrum og resulterer i organoider med en rig mangfoldighed af celletyper, der typisk findes i den udviklende menneskelige cortex. På trods af deres tidlige udviklingsmæssige sammensætning vil neuroner og andre menneskelige hjernecelletyper begynde at udvise de typiske tegn på ældning i neuronale celler efter langvarig in vitro-kultur , hvilket gør dem til en værdifuld og nyttig platform til at studere aldringsrelaterede neuronale processer. Denne protokol skitserer også en metode til påvisning af sådanne senescente celler i kortikale hjerneorganoider ved anvendelse af ældningsassocieret beta-galactosidasefarvning.
Vores nuværende viden om den menneskelige hjerne har i høj grad været baseret på dyremodeller og post mortem hjerneprøver. Stamcellebiologi er et hurtigt fremadskridende felt, der giver ny indsigt i den grundlæggende biologi i menneskelig hjerneudvikling og de patologiske drivkræfter for menneskelige hjernesygdomme. Humane pluripotente stamceller (hPSC’er) er et uvurderligt værktøj til modellering af den menneskelige hjerne via generering af organoider, organlignende tredimensionelt (3D) væv, der typisk rekapitulerer udviklingsbanerne, cellulær sammensætning og arkitektur i den udviklende menneskelige hjerne. Hjerneorganoider er selvsamlede og sammensat af neurale stamceller, specificerede neurale forfædre, modne neuroner og gliacelletyper. Organoider giver derfor en unik mulighed for at studere den tidlige menneskelige hjerne, som ofte er utilgængelig for direkte eksperimentering, men også har iboende begrænsninger såsom fraværet af vaskulatur og et immunsystem.
Metoder til at generere hjerneorganoider er blevet forfulgt på to forskellige måder: uguidet og guidet differentiering. Uguidede hjerneorganoidmetoder er afhængige af den spontane iboende differentieringskapacitet af stamcellerne, der driver vævsmorfogenese 1,2 og giver mulighed for fremkomsten af en række cellelinjeidentiteter lige fra forhjerne, mellemhjernen og baghjernen til choroid plexus, nethinden og mesoderm. I modsætning hertil kræver guidede hjerneorganoidmetoder betydelig brug af eksterne faktorer til at drive hPSC’er mod den ønskede mønsterdannelse af neuronale afstamninger, der repræsenterer en hjerneregionstype, såsom mediale ganglionic eminence3, forhjerne4, mellemhjerne5, hypothalamus6, cerebellum7 og choroid plexus8. Denne evne til at generere forskellige hjerneområder med forskellige cellelinjer og potentialet til at smelte disse efter ønske gør hjerneorganoider til en fremragende model til at undersøge menneskelig hjerneudvikling og dechiffrere de underliggende mekanismer for hjernerelaterede sygdomme. Selvom disse metoder til generering af hjerneorganoider tilbyder et gennembrud i modellering af menneskelige hjerneområder, forbliver variabiliteten og heterogeniteten mellem organoider en betydelig begrænsning for systematiske og kvantitative undersøgelser, såsom lægemiddelscreening.
Den nuværende protokol er baseret på en metode udviklet i vores nylige papir9 og involverer selektiv differentiering af hPSC-kolonier mod neuroektoderm (NEct) identitet med dobbelte SMAD-hæmmere (SB-431542 og LDN 193189), som derefter har evnen til selvorganisering inden for 4 dage i 3D neuroepithelium sfæroider under påvirkning af FGF2-signalering. Disse neuroepithelium sfæroider genererer pålideligt homogene kortikale organoider med en in vivo-lignende cellulær sammensætning inden for 4 uger efter differentiering. Protokollen beskrevet her er bygget på vores tidligere resultater, der viser, at hæmning af dobbelt SMAD (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) signalering fremmer differentieringen af hPSC’er mod rostral neurale stamceller afledt af neuroektodermale forfædre10 ved blandt andet at hæmme endodermal, mesodermal og trophectoderm celle skæbne valg11 . Desuden udløser indlejringen af neuroepitheliumsfæroider i den hESC-kvalificerede kældermembranmatrix signifikant spirende af neuroepithelia og danner ventrikler med apicobasal polaritet. Storskala kultur viste reproducerbarhed og homogenitet af kortikale organoider uafhængigt af cellelinjer, kloner eller batcher og repræsenterer således et pålideligt og stabilt stamcellesystem til at efterligne tidlig human kortikal udvikling i sundhed og sygdom in vitro. Vi skitserer yderligere en protokol til påvisning af senescente neuronale cellemarkører i hPSC-afledte kortikale hjerneorganoider, der er blevet dyrket i længere perioder.
Efter plettering af hPSC’er med en såtæthed på 20% -30% behandles cellerne med dobbelte SMAD-hæmmere i 3 dage for at differentiere hPSC-kolonier mod neuroektodermale kolonier. Disse kolonier løftes derefter forsigtigt med dispase og podes i ultralave fastgørelsesplader med 6 brønde suppleret med FGF2. De flydende 2D-kolonier organiserer sig selv i 3D neuroektodermale sfæroider natten over og opretholdes i 4 dage i N2-medium suppleret dagligt med FGF2. Når sfæroiderne har etableret det neuroepiteliske lag, kan de indlejres i kældermembranmatrixen. Ved rutinemæssigt at tilføje frisk terminal differentieringsmedium vil forskerne observere progressiv ekspansion og spirende neuroepithelia i kortikale organoider. Forskere ønsker måske at dissociere disse organoider for at udføre transkriptionel og proteomisk profilering. Derudover anbefales brightfield-billeddannelse til overvågning af kvaliteten af de kortikale organoider. Analyse kan udføres ved fiksering, kryosektion og immunostaining. Beskrivelser og metoder for disse teknikker er tidligere beskrevet12. I sidste ende giver denne protokol forskere mulighed for hurtigt og robust at generere homogene kortikale hjerneorganoider til modellering af den udviklende menneskelige kortikale hjerne med lave omkostninger og begrænset udstyr og til at studere aspekter af cellulær neuronal ældning, som beskrevet i dette papir.
For at muliggøre brugen af hPSC-afledte hjerneorganoider i lægemiddelscreening og sygdomsmodellering er det afgørende at fremstille organoider efter en replikerbar og pålidelig protokol15. Hjerneorganoider genereres almindeligvis fra embryoide kroppe afledt af hPSC’er, som derefter indlejres i en ekstracellulær matrix, der fremmer vævsudvidelse og neural differentiering. Sammenlignet med sådanne protokoller som Lancasters 1,16,17 og Velasco 18, der begynder fra embryoide kroppe og tillader en standarddifferentieringsvej, der skal følges af de udviklende organoider, har vi fundet ud af, at påbegyndelse af kortikal hjerneorganoiddannelse med humane NEct-celler snarere end med embryoide kroppe forbedrer konsistensen af kortikal hjerneorganoiddannelse. Dette giver derfor også mulighed for den skalering, der kræves til lægemiddel- og fænotypisk screening. Da humane NEct-celler ikke kun kan udvides til betydelige mængder, men også let kan kryopreserveres, forbedrer denne tilgang også replikabiliteten mellem eksperimenter. Det skal også bemærkes, at sammenlignet med andre protokoller, der har vedtaget brugen af bioreaktorer og lignende teknologier, kræves der ikke specialudstyr til denne protokol, hvilket gør den velegnet til ethvert laboratorium6. Endelig reduceres den tid, der kræves for at generere modne organoider, der er positive for kortikale lagmarkører som SATB2, sammenlignet med både Lancaster1– og bioreaktorprotokoller 6,19, hvilket gør den mere velegnet til at studere udviklingsbanen for menneskelig kortikal udvikling inden for sundhed og sygdomme 1,6,16.
I betragtning af den stadigt voksende globale sundhedseffekt af aldringsrelaterede sygdomme som demens, der er forbundet med en stigning i senescente celletyper i hjernen, der bidrager til patogenese, er evnen til at identificere og teste forbindelser, der kan forbedre hjernens aldring, af enorm interesse. På trods af at hPSC’er er kendt for at være epigenetisk forynget under omprogrammeringsprocessen20, finder vi robuste stigninger i senescente celler i kortikale hjerneorganoider dyrket i længere perioder. Dette er en lovende udvikling, der nu muliggør screening af lægemidler, der eliminerer sådanne senescente celler fra hjernen (senolytika), eller som bremser denne proces (senostatika)21. Da humane NEct-afledte kortikale hjerneorganoider er af menneskelig oprindelse, vil denne tilgang sandsynligvis forkorte den traditionelle vej til markedsføring af sådanne nye terapier.
Der er to kritiske trin i denne protokol. Den første er det korrekte niveau af sammenløb af hPSC-kolonierne på differentieringstidspunktet. hPSC-kolonier må højst være 30% sammenløbende for at sikre, at genererede NEct-kolonier ikke smelter sammen med nabokolonier, og at individuelle organoider er klonalt drevet. Det andet kritiske trin involverer korrekt brug af dispase til at løfte NEct-kolonierne og producere de neurale sfæroider. Tidspunktet for inkubation med dispase er afgørende for den eventuelle kvalitet af de neurale sfæroider, der genereres. Dette skyldes, at overeksponering af kolonier med dispase er giftig for cellerne22 og i sidste ende påvirker kvaliteten af genererede organoider. Begrænsningen af denne protokol er, at det er vanskeligt at kontrollere størrelsen af de neurale sfæroider, fordi det afhænger af størrelsen af de oprindelige kolonier, der løftes med dispase. Dette problem kan dog løses ved at vælge neurale sfæroider, der er af samme størrelse, når du fortsætter til indlejringsfasen.
Endelig kan fremtidige anvendelser udvides til at omfatte brugen af disse reproducerbare kortikale organoider i robotanalyse og biofarmaceutiske screeningsmetoder, der typisk anvendes i denne industri. Dette understøttes af foreløbige data fra vores laboratorium, der indikerer, at dannelsen af kortikale hjerneorganoider fra humane NEct-celler let kan automatiseres, hvilket gør det kompatibelt med disse tilgange.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af Medical Research Future Fund-Accelerated Research, Leukodystrophy flagskib Massimo’s Mission (EPCD000034), Medical Research Future Fund-Stem Cell Mission (APP2007653). Forfattere vil gerne takke Dr. Ju-Hyun Lee (Korea University) for at generere data i Supplerende video 1.
16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 4% of PFA are diluted in 1x PBS |
2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x) | Life Technologies Australia (TFS) | 21985023 | Used in NM and DM media |
B 27 Supplement 10 mL | Life Technologies Australia (TFS) | 17504044 | Used in NM and DM media |
CKX53 microscope with SC50 camera | Olympus | ||
Corning Costar 6 well cell culture plates | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3516-50EA | |
Dispase II powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 µm filter, aliquote at 10 mL and store at -20 °C |
DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | Thermofisher | 11320082 | Used in NM and DM media |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich Pty Ltd | D2650-100ML | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich Pty Ltd | D1408-500ML | |
Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix | In Vitro Technologies Pty Ltd | FAL354277 | Make aliquotes of 100 µL and stored at -20 °C |
GlutaMAX Supplement 100x | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used in NM and DM media |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich Pty Ltd | H8264 | |
Human induced pluripotent stem cells (EU79) | In-house reporogrammed from skin fibroblast | ||
Human induced pluripotent stem cells (G22) | Genea Biocells | Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States) | |
Human induced pluripotent stem cells (WTC) | Gift from Professor Bruce Conklin | ||
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542 | Merck | US1616464-5MG | |
Insulin Solution Human Recombinant | Sigma Aldrich Pty Ltd | I9278 | Used in NM and DM media |
LDN193189 Dihydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | SML0559-5MG | Used during differentiation |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used in NM and DM media |
mTeSR Plus | STEMCELL TECHNOLOGIES | 100-0276 | Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media |
N2 Supplement 5 mL (100x) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 17502048 | Used in NM and DM media |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Used in DM media |
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle) | Tissue Tek | 4583 | |
Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft | Sigma Aldrich Pty Ltd | P7793 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used in NM and DM media |
Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate | Sigma Aldrich Pty Ltd | CP1087 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 455946 | |
Prolong Glass Antifade Mountant | Life Technologies Australia (TFS) | P36980 | |
Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-01M | Aliquotes are made at 20 µg/mL and stored at -20 °C |
SB431542 | Tocris | 1614 | Used during differentiation |
Sucrose | Sigma Aldrich Pty Ltd | PHR1001-1G | 30% of sucrose are diluted in 1x PBS |
Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3473-24EA | |
X-GAL EA | Life Technologies Australia (TFS) | R0404 | Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 °C |