I denne studien gir vi en detaljert teknikk for et enkelt, men robust kortikalt organoidkultursystem ved bruk av standard materfrie hPSC-kulturer. Dette er en rask, effektiv og reproduserbar protokoll for å generere organoider som modellerer aspekter av hjernens senescens in vitro.
Hjerneorganoider er tredimensjonale modeller av den utviklende menneskelige hjerne og gir en overbevisende, banebrytende plattform for sykdomsmodellering og storskala genomisk og narkotika screening. På grunn av den selvorganiserende naturen til celler i hjerneorganoider og det voksende spekteret av tilgjengelige protokoller for deres generasjon, har problemer med heterogenitet og variabilitet mellom organoider blitt identifisert. I dette protokollpapiret beskriver vi en robust og replikerbar protokoll som i stor grad overvinner disse problemene og genererer kortikale organoider fra nevroektodermale forfedre innen 1 måned, og som kan opprettholdes i mer enn 1 år. Denne svært reproduserbare protokollen kan enkelt utføres i et standard vevskulturrom og resulterer i organoider med et rikt mangfold av celletyper som vanligvis finnes i den utviklende menneskelige cortex. Til tross for deres tidlige utviklingssammensetning, vil nevroner og andre menneskelige hjernecelletyper begynne å vise de typiske tegnene på senescens i nevronceller etter langvarig in vitro-kultur , noe som gjør dem til en verdifull og nyttig plattform for å studere aldringsrelaterte nevronprosesser. Denne protokollen skisserer også en metode for å oppdage slike senescentceller i kortikale hjerneorganoider ved bruk av senescensassosiert beta-galaktosidasefarging.
Vår nåværende kunnskap om den menneskelige hjerne har i stor grad vært basert på dyremodeller og post mortem hjerneprøver. Stamcellebiologi er et raskt fremmende felt som gir ny innsikt i den grunnleggende biologien til menneskelig hjerneutvikling og de patologiske driverne av menneskelige hjernesykdommer. Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er et uvurderlig verktøy for modellering av den menneskelige hjerne via generering av organoider, organlignende tredimensjonalt (3D) vev som vanligvis rekapitulerer utviklingsbaner, cellulær sminke og arkitektur av den utviklende menneskelige hjerne. Hjerneorganoider er selvmonterte og sammensatt av nevrale stamceller, spesifiserte nevrale forfedre, modne nevroner og gliacelletyper. Organoider gir derfor en unik mulighet til å studere den tidlige menneskelige hjernen, som ofte er utilgjengelig for direkte eksperimentering, men har også iboende begrensninger som fravær av vaskulatur og immunsystem.
Metoder for å generere hjerneorganoider har blitt forfulgt på to forskjellige måter: unguided og guidet differensiering. Unguided brain organoid metoder stole på spontane indre differensiering kapasiteter av stamceller som driver vev morfogenese 1,2 og tillater fremveksten av en rekke cellelinje identiteter som spenner fra forebrain, midbrain, og hindbrain, til choroid plexus, retina, og mesoderm. I motsetning til dette krever guidede hjerneorganoidmetoder betydelig bruk av eksterne faktorer for å drive hPSCs mot ønsket mønster av nevronlinjer som representerer en hjernegruppetype, for eksempel medial ganglionisk eminense3, forhjerne4, midthjerne5, hypothalamus6, cerebellum7 og choroid plexus8. Denne evnen til å generere forskjellige hjernegrupper med forskjellige cellelinjer, og potensialet til å smelte disse etter ønske, gjør hjerneorganoider til en utmerket modell for å undersøke menneskelig hjerneutvikling og dechiffrere de underliggende mekanismene for hjernerelaterte sykdommer. Selv om disse metodene for å generere hjerneorganoider gir et gjennombrudd i modellering av menneskelige hjernegrupper, er variasjonen og heterogeniteten mellom organoider fortsatt en betydelig begrensning for systematiske og kvantitative studier, for eksempel narkotikascreening.
Den nåværende protokollen er basert på en metode utviklet i vårt siste papir9 og innebærer selektiv differensiering av hPSC-kolonier mot nevroektoderm (NEct) identitet med doble SMAD-hemmere (SB-431542 og LDN 193189), som deretter har evnen til selvorganisering innen 4 dager i 3D neuroepiteliumsfæroider under påvirkning av FGF2-signalering. Disse neuroepitheliumsfæroidene genererer pålitelig homogene kortikale organoider med en in vivo-lignende cellulær sammensetning innen 4 uker etter differensiering. Protokollen beskrevet her er bygget på våre tidligere funn som viser at inhibering av dual SMAD (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) signalering fremmer differensiering av hPSCs mot rostrale nevrale stamceller avledet fra nevroektodermale stamceller10 ved blant annet å hemme endodermale, mesodermale og tropektodermcelle skjebnevalg11 . Videre utløser innebyggingen av nevroepitelsfæroidene i den hESC-kvalifiserte kjellermembranmatrisen signifikant spirende av nevroepitelia, og danner ventrikler med apikobasal polaritet. Storskalakultur viste reproduserbarhet og homogenitet av kortikale organoider uavhengig av cellelinjer, kloner eller batcher, og representerer dermed et pålitelig og stabilt stamcellesystem for å etterligne tidlig menneskelig kortikal utvikling i helse og sykdom in vitro. Vi skisserer videre en protokoll for å oppdage senescent neuronale cellemarkører i hPSCs-avledede kortikale hjerneorganoider som har blitt dyrket i lengre perioder.
Etter plating hPSCs ved en såtetthet på 20% -30%, behandles cellene med doble SMAD-hemmere i 3 dager for å skille hPSC-kolonier mot nevroektodermale kolonier. Disse koloniene løftes deretter forsiktig med dispase og sås inn i ultralavt feste 6-brønns plater supplert med FGF2. De flytende 2D-koloniene organiserer seg selv i 3D nevroektodermale sfæroider over natten og opprettholdes i 4 dager i N2-medium supplert daglig med FGF2. Når sfæroidene har etablert det nevroepiteliale laget, kan de legges inn i kjellermembranmatrisen. Ved rutinemessig å legge til fersk terminal differensieringsmedium, vil forskerne observere progressiv ekspansjon og spirende av nevroepithelia i kortikale organoider. Forskere kan ønske å dissosiere disse organoidene for å utføre transkripsjonell og proteomisk profilering. I tillegg anbefales brightfield imaging for å overvåke kvaliteten på de kortikale organoider. Analyse kan utføres ved fiksering, kryoseksjon og immunostaining. Beskrivelser og metoder for disse teknikkene er tidligere beskrevet12. Til syvende og sist tillater denne protokollen forskere å raskt og robust generere homogene kortikale hjerneorganoider for modellering av den utviklende menneskelige kortikale hjernen, med lave kostnader og begrenset utstyr, og for å studere aspekter av cellulær nevronal senescens, som beskrevet i dette papiret.
For å muliggjøre bruk av hPSC-avledede hjerneorganoider i narkotikascreening og sykdomsmodellering, er det avgjørende å lage organoider etter en replikerbar og pålitelig protokoll15. Hjerneorganoider genereres vanligvis fra embryoide legemer avledet fra hPSCs, som deretter er innebygd i en ekstracellulær matrise som fremmer vevsutvidelse og nevral differensiering. Sammenlignet med slike protokoller som Lancasters 1,16,17 og Velasco18, som begynner fra embryoide legemer og tillater en standard differensieringsvei som skal følges av de utviklende organoider, har vi funnet ut at oppstart av kortikal hjerneorganoiddannelse med humane NEct-celler i stedet for med embryoide legemer forbedrer konsistensen av kortikal hjerneorganoiddannelse. Dette gir derfor også mulighet for skalering som kreves for legemiddel- og fenotypisk screening. Siden menneskelige NEct-celler ikke bare kan utvides til betydelige mengder, men også lett kan kryopreserveres, forbedrer denne tilnærmingen også replikerbarheten mellom eksperimenter. Det skal også bemerkes at sammenlignet med andre protokoller som har vedtatt bruk av bioreaktorer og lignende teknologier, er det ikke nødvendig med spesialutstyr for denne protokollen, noe som gjør den egnet for ethvert laboratorium6. Til slutt reduseres tiden som kreves for å generere modne organoider som er positive for kortikale lagmarkører som SATB2 sammenlignet med både Lancaster1 og bioreaktorprotokoller 6,19, noe som gjør den mer egnet til å studere utviklingsbanen for menneskelig kortikal utvikling i helse og sykdommer 1,6,16.
Videre, gitt den stadig voksende globale helsevesenets innvirkning av aldringsrelaterte sykdommer som demens, som er forbundet med en økning i senescentcelletyper i hjernen som bidrar til patogenese, er evnen til å identifisere og teste forbindelser som kan forbedre hjernens aldring av enorm interesse. Til tross for at hPSC er kjent for å bli epigenetisk forynget under omprogrammeringsprosessen20, finner vi robuste økninger i senescentceller i kortikale hjerneorganoider dyrket i lengre perioder. Dette er en lovende utvikling som nå muliggjør screening av legemidler som eliminerer slike senescentceller fra hjernen (senolytika) eller som bremser denne prosessen (senostatika)21. Siden menneskelige NEct-avledede kortikale hjerneorganoider er av menneskelig opprinnelse, vil denne tilnærmingen sannsynligvis forkorte den tradisjonelle veien til å markedsføre slike nye terapier.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er det riktige nivået av sammenløp av hPSC-koloniene på tidspunktet for differensiering. hPSC-kolonier må maksimalt være 30% konfluente for å sikre at genererte nektkolonier ikke smelter sammen med nabokolonier og at individuelle organoider er klonalt drevet. Det andre kritiske trinnet innebærer riktig bruk av dispase for å løfte NEct-koloniene og produsere nevrale sfæroider. Tidspunktet for inkubasjon med dispase er avgjørende for den endelige kvaliteten på de nevrale sfæroider som genereres. Dette skyldes at overeksponering av kolonier med dispase er giftig for cellene22 og til slutt påvirker kvaliteten på genererte organoider. Begrensningen av denne protokollen er at det er vanskelig å kontrollere størrelsen på nevrale sfæroider fordi det er avhengig av størrelsen på de første koloniene som løftes med dispase. Dette problemet kan imidlertid løses ved å velge nevrale sfæroider som er av samme størrelse når du går videre til innebyggingsstadiet.
Endelig kan fremtidige applikasjoner strekke seg til bruk av disse reproduserbare kortikale organoider i robotanalyse og biofarmasøytiske screeningsmetoder som vanligvis brukes i den bransjen. Dette støttes av foreløpige data fra vårt laboratorium som indikerer at genereringen av kortikale hjerneorganoider fra humane NEct-celler lett kan automatiseres, noe som gjør den kompatibel med disse tilnærmingene.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av Medical Research Future Fund-Accelerated Research, Leukodystrophy flaggskip Massimo’s Mission (EPCD000034), Medical Research Future Fund-Stem Cell Mission (APP2007653). Forfattere vil gjerne takke Dr. Ju-Hyun Lee (Korea University) for å generere data i Supplementary Video 1.
16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 4% of PFA are diluted in 1x PBS |
2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x) | Life Technologies Australia (TFS) | 21985023 | Used in NM and DM media |
B 27 Supplement 10 mL | Life Technologies Australia (TFS) | 17504044 | Used in NM and DM media |
CKX53 microscope with SC50 camera | Olympus | ||
Corning Costar 6 well cell culture plates | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3516-50EA | |
Dispase II powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 µm filter, aliquote at 10 mL and store at -20 °C |
DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | Thermofisher | 11320082 | Used in NM and DM media |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich Pty Ltd | D2650-100ML | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich Pty Ltd | D1408-500ML | |
Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix | In Vitro Technologies Pty Ltd | FAL354277 | Make aliquotes of 100 µL and stored at -20 °C |
GlutaMAX Supplement 100x | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used in NM and DM media |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich Pty Ltd | H8264 | |
Human induced pluripotent stem cells (EU79) | In-house reporogrammed from skin fibroblast | ||
Human induced pluripotent stem cells (G22) | Genea Biocells | Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States) | |
Human induced pluripotent stem cells (WTC) | Gift from Professor Bruce Conklin | ||
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542 | Merck | US1616464-5MG | |
Insulin Solution Human Recombinant | Sigma Aldrich Pty Ltd | I9278 | Used in NM and DM media |
LDN193189 Dihydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | SML0559-5MG | Used during differentiation |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used in NM and DM media |
mTeSR Plus | STEMCELL TECHNOLOGIES | 100-0276 | Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media |
N2 Supplement 5 mL (100x) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 17502048 | Used in NM and DM media |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Used in DM media |
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle) | Tissue Tek | 4583 | |
Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft | Sigma Aldrich Pty Ltd | P7793 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used in NM and DM media |
Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate | Sigma Aldrich Pty Ltd | CP1087 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 455946 | |
Prolong Glass Antifade Mountant | Life Technologies Australia (TFS) | P36980 | |
Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-01M | Aliquotes are made at 20 µg/mL and stored at -20 °C |
SB431542 | Tocris | 1614 | Used during differentiation |
Sucrose | Sigma Aldrich Pty Ltd | PHR1001-1G | 30% of sucrose are diluted in 1x PBS |
Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3473-24EA | |
X-GAL EA | Life Technologies Australia (TFS) | R0404 | Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 °C |