Småskala ekstraktion af Caenorhabditis elegans Genomisk DNA
Summary
Præsenteret her er en beskrivelse af den ligetil og relativt hurtige isolering af Caenorhabditis elegans genomisk DNA fra et eller nogle få dyr ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt vævssæt. Det resulterende gDNA-præparat er en passende skabelon til PCR.
Abstract
Genomisk DNA-ekstraktion fra enkelte eller nogle få Caenorhabditis elegans har mange nedstrøms applikationer, herunder PCR til genotekypinglinjer, kloning og sekventering. De traditionelle proteinase K-baserede metoder til genomisk DNA-ekstraktion fra C. elegans tager flere timer. Kommercielle ekstraktionssæt, der effektivt bryder C. elegans neglebånd og ekstrakt genomisk DNA, er begrænsede. En nem, hurtigere (~ 15 min) og omkostningseffektiv metode til ekstraktion af C. elegans genomisk DNA, der fungerer godt til klasseværelses- og forskningsapplikationer, rapporteres her. Denne DNA-ekstraktionsmetode er optimeret til at anvende enkelte eller nogle få senlarver (L4) eller voksne nematoder som udgangsmateriale til opnåelse af en pålidelig skabelon til udførelse af PCR. Resultaterne tyder på, at DNA-kvaliteten er egnet til at forstærke genmål af forskellig størrelse ved PCR, hvilket tillader genotypning af enkelte eller nogle få dyr selv ved fortyndinger til en halvtredsindstyvende del af det genomiske DNA fra en enkelt voksen pr. reaktion. De rapporterede protokoller kan pålideligt bruges til hurtigt at producere DNA-skabelon fra en enkelt eller en lille prøve af C. elegans til PCR-baserede applikationer.
Introduction
Her præsenteres to relaterede protokoller for lysis af Caenorhabditis elegans for at gøre DNA tilgængeligt for PCR-baserede applikationer. PCR er en almindeligt anvendt molekylær teknik, der anvendes til mange applikationer, herunder genotypning og forstærkning af DNA-fragmenter til kloning og sekventering, blandt andre. Den lille (1 mm), fritlevende rundorm C. elegans er et populært dyresystem til biologisk forskning. Opnåelse af egnet genomisk DNA fra et enkelt dyr eller nogle få dyr er tilstrækkeligt til at forstærke sekvensen ved PCR. Sene L4 larver og voksne indeholder kun ~ 1.000 somatiske celler (herunder nogle multi-nukleare, polyploide celler), kimceller og (hvis dyret er en gravid hermafrodit) afkom i utero1. Disse dyr er dog beskyttet af en neglebånd, der skal forstyrres for at ekstrahere det genomiske DNA2. Standardmetoder til fremstilling af nematode genomisk DNA-skabelon til PCR involverer flere trin og tager flere timer. Dyrene fryses først i ormelysebuffer indeholdende proteinase K (-70 °C eller derunder) i mindst 15-45 minutter (længere anbefales i nogle protokoller)3,4,5,6. Dette trin revner åbne dyrene.
Efter frysning inkuberes dyrene i 1 time ved 60-65 °C, så proteinasen K virker, hvorefter enzymet inaktiveres i 15-30 min ved 95 °C. Proteinasen K ødelægger nukleaserne, der nedbryder DNA. Inaktivering af proteinase K før PCR er vigtig for at forhindre, at proteinasen K nedbryder DNA-polymerasen. De to kitbaserede protokoller, der er beskrevet her, er hurtige, pålidelige og omkostningseffektive metoder til at udtrække genomisk DNA fra enten et enkelt dyr eller et par nematoder til daglig forskning og undervisning i laboratorieapplikationer. Det anvendte sæt blev oprindeligt optimeret af producenten til at udtrække DNA fra animalsk væv, spyt og hår7. Det bruger en proprietær vævsforberedelsesopløsning og ekstraktionsopløsning til at lyse celler og gøre genomisk DNA tilgængeligt. En proprietær neutraliseringsopløsning neutraliserer derefter de komponenter, der kan hæmme PCR (f.eks. Salte, ioner og Mg2 + -bindende molekyler).
Ved genotypning kan et enkelt dyr testes. Når det skal afgøres, om en stamme er homozygot, giver test af seks eller flere afkom fra et enkelt dyr stor tillid til, at en linje er homozygot eller ej (der er 0,02% chance for tilfældigt at vælge seks homozygote mutante afkom fra en heterozygot forælder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Denne metode 1) er ligetil, med færre trin end proteinase K-metoden, og 2) reducerer skabelonforberedelsestiden til 15 min. Resultaterne i dette arbejde viser, at den udviklede protokol fungerer robust ved ekstraktion af genomisk DNA fra enkelte eller nogle få orme, som pålideligt kan bruges til downstream-applikationer, der ikke kræver stærkt oprenset DNA, herunder PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestemmelse af genotyperne af C. elegans er et vigtigt skridt, mens du udfører genetiske kryds for at skabe nye C. elegans stammer. Genomisk DNA-ekstraktion ved hjælp af en enkelt eller få C. elegans er et afgørende skridt i genotypning af C. elegans. Denne protokol beskriver genomisk DNA-ekstraktion fra C. elegans ved hjælp af et kommercielt kit. Denne metode er hurtig og fungerer robust. Det genomiske DNA, der ekstraheres ved hjælp af denne metode, kan bruges til downs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N2-stammen og E. coli OP50-bakterierne blev opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Blmp-1 (tm548) stammen blev opnået fra National Bioresource Project, Japan. Forfatterne takker WormBase. Dette arbejde blev støttet af NIH R01GM097591 til T.L.G., intern finansiering fra Texas Woman’s University til T.L.G og TWU’s Center for Student Research til M.F.L.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genética. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
