Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

Summary

O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.

Abstract

O incisivo murino é um órgão que cresce continuamente ao longo da vida útil do rato. As células-tronco epiteliais e mesenquimais que residem nos tecidos proximais dos incisivos dão origem à progênie que se diferenciará em ameloblastos, odontoblastos e fibroblastos pulpar. Essas células são cruciais para suportar o turnover sustentado dos tecidos incisivos, tornando o incisivo murino um excelente modelo para estudar a homeostase de células-tronco adultas. Acredita-se que as células-tronco contenham células quiescentes de vida longa que podem ser marcadas por análogos de nucleotídeos, como 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). As células retêm esse rótulo ao longo do tempo e, consequentemente, são chamadas de células de retenção de rótulo (LRCs). Abordagens para visualização de LRCs in vivo fornecem uma ferramenta robusta para monitorar a homeostase de células-tronco. Neste estudo, descrevemos um método para visualização e análise de LRCs. Nossa abordagem inovadora apresenta LRCs em incisivos de camundongos após limpeza do tecido e coloração de EdU de montagem total, seguida de microscopia confocal e reconstrução 3D (3D) com o software de imagem. Este método permite a aquisição de imagens 3D e quantificação não enviesada em comparação com a análise tradicional de LRCs em lâminas seccionadas.

Introduction

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo é um excelente modelo para o estudo de células-tronco adultas¹. As células-tronco epiteliais (alça cervical labial e lingual) e mesenquimais (entre a alça cervical labial e lingual) que residem na face proximal do incisivo diferenciam-se em ameloblastos, odontoblastos e células da polpa dentária. Este processo único fornece uma fonte de células para compensação da perda e turnover tecidual². Embora vários marcadores de células-tronco como Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, etc. foram identificadas in vivo para os subgrupos de células-tronco adultas em incisivos de camundongos, que são inadequadas para representar as populações de células-tronco quando usadas isoladamente 1,3,4,5. A visualização de células quiescentes de vida longa por marcação e retenção de DNA análogo a nucleotídeos poderia fornecer detecção imparcial para a maioria dos subconjuntos de células-tronco adultas⁶. Além disso, essa abordagem é útil entre muitos métodos de identificação de células-tronco⁷ para entender o comportamento celular e a homeostase de populações de células-tronco dentárias ^3,8. Enquanto as células-tronco em divisão perderiam sua marcação de DNA após uma perseguição considerável, as supostas células-tronco quiescentes retêm seu rótulo de DNA, considerando-as células retentoras de marcação (LRCs)⁶. A marcação e retenção do DNA por células-tronco não em divisão marcará e localizará as células-tronco adultas putativas em seus nichos.

Nos últimos anos, a marcação com 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) análogo da timidina substituiu o método pesado, demorado e incompatível de marcação de DNA 3H-timidina por microscopia de alta resolução para ensaios de proliferação celular ^6,9. Nos últimos anos, a técnica de marcação com 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) tem sido cada vez mais utilizada em relação à BrdU. Esse padrão surgiu por vários motivos. Primeiro, o método BrdU é lento e trabalhoso. As condições do usuário são variáveis, e é incapaz de preservar a ultraestrutura nos espécimes (devido à desnaturação do DNA). Da mesma forma, o método BrdU perde a antigenicidade das células, tornando-o ineficiente para análises funcionais a jusante e ensaios como os experimentos de co-localização e transplante in vivo de células-tronco 3,7,9,10,11,12. O BrdU também é um teratógeno, que não é adequado para marcação de LRCs no desenvolvimento embrionário⁶. Além disso, o método BrdU é ineficiente quando usado em amostras de montagem inteira. As desvantagens são a baixa penetração de anticorpos na parte profunda dos espécimes ou a necessidade de um longo período de incubação de anticorpos para penetração profunda¹³. A marcação EdU escapa das etapas de desnaturação dos espécimes, preservando assim a ultraestrutura. Essa característica é vantajosa para análises funcionais a jusante, como experimentos de co-localização e transplante de células-tronco^11,12. Além disso, a marcação EdU é altamente sensível e rápida; A penetração do espécime é alta devido ao uso de azidas fluorescentes de menor tamanho e rápida absorção para detecção de etiquetas de EdU através de uma reação de cicloadição [3 + 2] catalisada por(I) (“química de clique”)¹⁴.

Outro método de marcação de DNA cada vez mais aplicado é o uso de camundongos transgênicos modificados. Esses camundongos expressam a proteína fluorescente verde da histona 2B (H2B-GFP) controlada por um elemento regulador responsivo à tetraciclina ^5,14. Depois de alimentar camundongos com ração/água de tetraciclina por um período de perseguição de 4 semanas a 4 meses, a fluorescência da GFP diminuirá nas células cicladoras e apenas as LRCs reterão a fluorescência⁶. A vantagem desse método é que as LRCs marcadas podem ser isoladas e permanecem viáveis para cultura celular ou análises funcionais a jusante ^6,7. Alguns estudos relataram marcação imprecisa de células-tronco quiescentes quando perseguidas para uso a longo prazo. Esse resultado foi devido a uma expressão de fundo vazada da cepa H2B-GFP e não à resposta apropriada regulada por tetraciclina¹⁵.

Além disso, a maioria da literatura no passado usava a detecção de LRCs principalmente em lâminas seccionadas, que são bidimensionais e muitas vezes erroneamente enviesadas para mostrar a localização precisa e o número de LRCs. A abordagem mostrou ângulos incorretos para cortes de estruturas teciduais complexas¹⁶. O outro método foi obter imagens 3D a partir de cortes seriados e realizar reconstruções pós-imagem. Esses passos foram imprecisos devido à distorção da imagem a partir de variações em cada corte seriado devido a cortes comprimidos ou esticados, resultando em informações ausentes^16,17,18. O método também era trabalhoso e demorado.

Para facilitar a obtenção de imagens de montagem completa de LRCs, as amostras precisam ser esclarecidas enquanto a fluorescência é bem mantida. As técnicas atuais de limpeza de tecidos podem ser classificadas em três grandes categorias: técnicas de limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos, técnicas de limpeza de tecidos à base de reagentes aquosos e técnicas de limpeza de tecidos à base de hidrogel^17,19. O sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS) foi recentemente desenvolvido. Essa abordagem torna quase todos os tipos de tecidos transparentes e preserva a fluorescência endógena, incluindo tecidos duros, como osso e dentes²⁰. O método PEGASOS apresenta vantagens sobre outros métodos de limpeza tecidual, especialmente na limpeza de materiais dentários e ósseos. A maioria dos outros métodos poderia limpar apenas parcialmente tecidos duros, ter longos tempos de processamento ou exigir reagentes dispendiosos²¹. Além disso, o método PEGASOS pode preservar eficientemente a fluorescência endógena em relação a outros métodos.

Essa literatura nos levou a criar um novo método para o estudo celular. Combinamos as vantagens de detecção de LRCs da marcação de EdU com a imagem 3D de montagem completa mais superior de espécimes desembaraçados de tecido; amostras foram processadas com técnica avançada de limpeza tecidual do sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS)¹⁵. A transparência do tecido duro nos permitiu reconstruir o sinal 3D da fluorescência das LRCs in vivo sem quebrar os dentes ou a mandíbula, criando uma maneira mais precisa de visualizar e quantificar as LRCs.

Neste estudo, fornecemos um guia inovador para visualização de LRCs no incisivo de camundongos. Fizemos uma abordagem visual 3D para determinar a localização e a quantidade de LRCs dentro do nicho de células-tronco incisivas de camundongos. Este projeto utilizou marcação com EdU, técnicas de limpeza tecidual PEGASOS e microscopia confocal. Nosso método de marcação de EdU as LRCs em tecido montado inteiro e o uso de um espécime limpo e transparente superam as limitações das lâminas seccionadas tradicionais e outros métodos desvantajosos de marcação de DNA. Assim, nossa técnica será adequada para estudos sobre homeostase de células-tronco que necessitem de detecção de LRCs, especialmente em tecidos duros. O protocolo pode ser igualmente vantajoso para aqueles que enfocam a homeostase de células-tronco em outros tecidos e órgãos.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) para a Texas A&M University College of Dentistry. 1. Preparação do coquetel de rotulagem EdU Preparar as soluções de coquetel conforme descrito na Tabela 1. Preparar o coquetel de rotulagem da EdU conforme descrito na Tabela 1. 2. Preparação dos ratos e da solução de EdU</…

Representative Results

Após a marcação da EdU e o processo de limpeza tecidual PEGASOS (Figura 2), a mandíbula transparente foi obtida como mostrado em nossa imagem (Figura 3B). Comparamos a amostra modificada com uma mandíbula normal sem processo de limpeza tecidual (Figura 3A). A mandíbula transparente (Figura 3B) com marcação de EdU foi submetida a imagens confocais. Focamos no ápice do incisivo mostrando o nicho …

Discussion

Doses múltiplas de injeções (BrdU, EdU) são geralmente usadas em camundongos neonatais em crescimento para marcar ao máximo as células em proliferação ^1,6,13. O período de perseguição é considerado uma etapa crítica em relação à taxa de renovação dos tecidos ^6,13. O incisivo do rato renova-se todos os meses. Essa característica permite que os pesquisad…

Materials

0.5 M EDTA	Sigma Aldrcih	E9884
20 × Objective/NA 0.9	Leica	507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes	Falcon	352070
BD PrecisionGlide Needle	BD	REF 305111
Bezyl benzoate (BB)	Sigma Aldrcih	409529
Bitplane 9.0.1	Imaris
BRAND cavity slides	Millipore Sigma	BR475505
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Strain #:000664
Circulation Pump	VWR	23609-170
CuSO4	Sigma Aldrcih	451657
DMSO	Sigma Aldrcih	D8418
EdU	Carboynth	NE08701
Heparin	Miiilipore Sigma	H3149
Imaging System	Olympus	DP27
LAS X Software	Leica
Olympus Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Paraformaldehye	Sigma Aldrich	P6148
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PEGMMA500	Sigma Aldrich	447943
Quadrol	Sigma Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide	Lumiprobe	D1330
TBS-10X	Cell Signaling Technology	12498
TCS SP8 Confocal Microscope	Leica
tert-butanol (tB)	Sigma Aldrich	360538
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100