La sensibilité de la membrane mitochondriale interne au Na+ révèle des pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés

Summary

Ce protocole décrit un test comparatif, utilisant des activités complexes mitochondriales CI+CIII et CII+CIII en présence ou en l’absence de Na⁺, pour étudier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés.

Abstract

Les pools d’ubiquinone (CoQ) dans la membrane mitochondriale interne (IMM) sont partiellement segmentés en enzymes complexes I ou dépendantes de la FAD. Une telle subdivision peut être facilement évaluée par un essai comparatif utilisant le NADH ou le succinate comme donneurs d’électrons dans les mitochondries congelées-décongelées, dans lequel la réduction du cytochrome c (cyt c) est mesurée. Le test repose sur l’effet de Na⁺ sur l’IMM, diminuant sa fluidité. Nous présentons ici un protocole pour mesurer l’activité de la NADH-cyt c oxydoréductase et les activités de la succinate-cyt c oxydoréductase en présence de NaCl ou de KCl. Les réactions, qui reposent sur le mélange de réactifs dans une cuvette de manière progressive, sont mesurées spectrophotométriquement pendant 4 min en présence de Na⁺ ou K⁺. Le même mélange est réalisé en parallèle en présence des inhibiteurs enzymatiques spécifiques afin de soustraire le changement non spécifique d’absorbance. L’activité de la NADH-cyt c oxydoréductase ne diminue en présence d’aucun de ces cations. Cependant, l’activité de la succinate-cyt c oxydoréductase diminue en présence de NaCl. Cette expérience simple met en évidence : 1) l’effet de Na⁺ sur la diminution de la fluidité de l’IMM et du transfert de CoQ ; 2) que le supercomplexe I+III₂ protège le transfert d’ubiquinone (CoQ) d’être affecté par l’abaissement de la fluidité de l’IMM; 3) que le transfert de CoQ entre CI et CIII est fonctionnellement différent du transfert de CoQ entre CII et CIII. Ces faits soutiennent l’existence de pools de CoQ fonctionnellement différenciés dans l’IMM et montrent qu’ils peuvent être régulés par l’environnement Na⁺ changeant des mitochondries.

Introduction

Le système de phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) est la principale voie conduisant à la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP), à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et à la consommation d’équivalents réducteurs, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) ou le succinate, par les mitochondries. Le système OXPHOS est composé de cinq complexes protéiques : le complexe I (IC) oxyde le NADH et réduit la CoQ en ubiquinol (CoQH₂). Le complexe II (CII) oxyde le succinate en fumarate et réduit la CoQ en_CoQH2. Le complexe III (CIII) oxyde la CoQH₂ en CoQ, réduisant ainsi le cytochrome c (cyt c). Enfin, le complexe IV (CIV) oxyde le cyt c et réduit l’oxygène en eau. Cette chaîne d’oxydoréduction, appelée chaîne de transport d’électrons (mETC), est couplée au pompage de H⁺ à travers l’IMM, ce qui crée un gradient électrochimique utilisé par le complexe V (CV) pour phosphoryler l’adénosine diphosphate (ADP) en ATP.

Les complexes mETC peuvent être seuls dans l’IMM ou s’assembler en structures quaternaires appelées supercomplexes. Le CIV peut s’assembler avec le CIII, formant le III₂+IV ou le Q-respirasome (car il est capable de respirer en présence de CoQH₂)^1,2,3 ou formant des homodimères ou des homooligomères⁴. CIII peut interagir avec CI, formant le supercomplexe I +III₂⁵. Enfin, l’IC est également capable d’interagir avec le Q-respirasome, en construisant le I + III₂ + IV ou le N-respirasome (car il peut respirer en consommant du NADH)^1,6,7,8,9,10.

CoQ et cyt c sont des transporteurs d’électrons mobiles chargés de transférer des électrons de CI/CII à CIII, et de CIII à CIV, respectivement. La question de savoir si les supercomplexes imposent ou non une restriction locale fonctionnelle à ces transporteurs a fait l’objet d’un débat intense au cours des deux dernières décennies 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Cependant, plusieurs groupes indépendants ont démontré que coq et cyt c peuvent être segmentés fonctionnellement en pools dans l’IMM. En ce qui concerne la CoQ, elle peut être segmentée fonctionnellement en un pool de CoQ spécifique pour l’IC (CoQ^NAD) et un autre pool dédié aux enzymes dépendantes de la DCP (CoQ^FAD)^1,7,12,18,19. Cependant, afin de différencier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés, la surexpression de l’oxydase alternative (AOX) et la génération de mutants spécifiques de l’ADNmt, qui peuvent assembler l’IC en l’absence de CIII, ont été nécessaires ^1,19,20.

Le mécanisme de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pendant l’hypoxie était inconnu jusqu’à récemment. En cas d’hypoxie aiguë, l’IC subit la transition active/décactive (A/D), qui implique la diminution de son activité oxydoréductase de pompage H⁺ NADH-CoQ. Une telle diminution du pompage H⁺ acidifie la matrice mitochondriale et dissout partiellement les précipités de calcium-phosphate dans la matrice mitochondriale, libérant^{du Ca 2+} soluble. Cette augmentation du Ca²⁺ soluble active l’échangeur Na⁺/Ca²⁺ (NCLX), qui extrude le Ca²⁺ en échange de Na⁺. L’augmentation mitochondriale de Na⁺ interagit avec les phospholipides de la face interne de l’IMM, diminuant sa fluidité et son transfert de CoQ entre CII et CIII, produisant finalement un anion superoxyde, un signal redox²¹. Fait intéressant, le transfert de CoQ n’a diminué qu’entre CII et CIII, mais pas entre CI et CIII, soulignant que 1) Na⁺ n’était capable de moduler qu’un seul des pools de CoQ existants dans les mitochondries; 2) il existe des pools de CoQ fonctionnellement différenciés dans l’IMM. Ainsi, un protocole largement utilisé pour l’étude des activités enzymatiques mitochondriales peut être utilisé pour évaluer l’existence des pools de CoQ mentionnés.

Le protocole actuel est basé sur la mesure de la réduction du cyt c oxydé, le substrat de CIII, par absorbance en présence de succinate (c.-à-d. substrat CII) ou de NADH (c.-à-d. substrat CI). Le même échantillon est divisé en deux, dont l’un sera traité avec du KCl et l’autre avec la même concentration de NaCl. De cette façon, étant donné que Na⁺ diminue la fluidité de l’IMM, si la CoQ existait dans un pool unique dans l’IMM, CI+CIII et CII+CIII diminueraient en présence de Na⁺. Cependant, si la CoQ existait dans des pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés, l’effet de Na⁺ serait principalement (ou seulement) évident sur l’activité CII+CIII, mais pas sur l’IC+CIII. Comme récemment publié²¹, Na⁺ n’affecte que le transfert de CoQ entre CII et CIII (Figure 1C,D), mais pas entre CI et CIII (Figure 1A,B).

Ce protocole, ainsi qu’une panoplie de techniques, a été utilisé pour confirmer l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés dans l’IMM, l’un dédié à l’IC (c.-à-d.^{le NAD} de CoQ) et l’autre aux enzymes liées à la DCP (c.-à-d. la^DCP de CoQ)^1,3,7; une observation qui, bien qu’elle continue d’être débattue²², a été corroborée indépendamment par plusieurs groupes ^7,19. Ainsi, le superassemblage de CI en supercomplexes a un impact sur la mobilité locale de la CoQ, facilitant son utilisation par le CIII au sein du supercomplexe ^{1,7,13,14,23,24,25}.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnel du Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espagne, conformément à la directive de l’Union européenne du 22 septembre 2010 (2010/63/UE) et au décret royal espagnol du 1er février 2013 (53/2013). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux utilisés e…

Representative Results

Les résultats typiques de ce protocole sont représentés ci-dessous (Figure 3). Comme l’absorbance cyt c réduite se situe à 550 nm, tous les sous-échantillons non inhibés doivent montrer une augmentation de l’absorbance à 550 nm. Les sous-échantillons inhibés montrent idéalement une ligne plate ou une pente légèrement croissante (Figure 3). Les pentes des sous-échantillons inhibés doivent être soustraites des sous-échantillons non inhibés.</…

Discussion

Bien que ce protocole représente une procédure très simple pour identifier l’existence des pools de CoQ partiellement segmentés, il y a quelques étapes critiques à prendre en compte. Les substrats (c.-à-d. le NADH ou le succinate) sont de préférence ajoutés en dernier puisque l’autooxydation de ces composés peut se produire. Le retournement de la cuvette doit être prudent afin d’éviter la formation de bulles qui peuvent interférer avec la lecture.

En outre, la technique act…

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	10775835001
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000001
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C7752
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Malonic acid	Sigma-Aldrich	M1296
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
Potassium cyanide	Sigma-Aldrich	207810
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Spectra Manager software	JASCO	version 2
Spectrophotometer	UV/VISJASCO
Succinate	Sigma-Aldrich	398055