Engineering og karakterisering av en optogenetisk modell av det menneskelige nevromuskulære krysset
Summary
Vi beskriver et reproduserbart, automatisert og objektivt bildebehandlingssystem for karakterisering av nevromuskulær kryssfunksjon ved bruk av humant konstruert skjelettmuskulaturvev og optogenetiske motoneuroner. Dette systemet muliggjør funksjonell kvantifisering av nevromuskulær tilkobling over tid og oppdager redusert nevromuskulær funksjon forårsaket av nevrotoksiner og myasthenia gravis pasientserum.
Abstract
Mange nevromuskulære sykdommer, som myasthenia gravis (MG), er forbundet med dysfunksjon av det nevromuskulære krysset (NMJ), som er vanskelig å karakterisere i dyremodeller på grunn av fysiologiske forskjeller mellom dyr og mennesker. Tissue engineering tilbyr muligheter til å gi in vitro modeller av funksjonelle menneskelige NMJs som kan brukes til å diagnostisere og undersøke NMJ-patologier og teste potensielle terapier. Ved å inkorporere optogenetiske proteiner i induserte pluripotente stamceller (iPSCs), genererte vi nevroner som kan stimuleres med spesifikke bølgelengder av lys. Hvis NMJ er sunn og funksjonell, resulterer et nevrokjemisk signal fra motoneuronet i muskelkontraksjon. Gjennom integrering av optogenetikk og mikrofabrikasjon med vevsteknikk etablerte vi en objektiv og automatisert metodikk for karakterisering av NMJ-funksjon ved hjelp av videoanalyse. En standardisert protokoll ble utviklet for NMJ-dannelse, optisk stimulering med samtidig videoopptak og videoanalyse av vevskontraktilitet. Stimulering av optogenetiske motoneuroner ved lys for å indusere skjelettmuskelkontraksjoner rekapitulerer human NMJ-fysiologi og muliggjør gjentatte funksjonelle målinger av NMJ over tid og som respons på ulike innganger. Vi demonstrerer denne plattformens evne til å vise funksjonelle forbedringer i nevromuskulær tilkobling over tid og karakterisere de skadelige effektene av pasientens MG-antistoffer eller nevrotoksiner på NMJ-funksjonen.
Introduction
Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er den kjemiske synapsen mellom motoneuroner (MN) og skjelettmuskelceller (SkM) som muliggjør muskelkontraksjon. Toksiner, som nevrotoksin α-bungarotoxin (BTX), eller nevromuskulære sykdommer (NMD) som myasthenia gravis (MG) kan føre til degenerasjon av NMJ og reduksjoner i muskelkontroll1. Bioengineered humane vevsmodeller rekapitulerer bedre de funksjonelle og fysiologiske mekanismene til humane NMJ og gir større translasjonspotensial enn dyremodeller.
Mens dyremodeller har avansert forståelsen av dannelsen og funksjonen til NMJ, er det signifikante forskjeller mellom synapser mellom mennesker og dyr som begrenser oversettelsen av resultatene til mennesker og gjør in vivo karakterisering av NMJ utfordrende 2,3,4. Studier har vist tydelige fysiologiske forskjeller mellom mus og menneskelige NMJs. Mus har større NMJ og mindre aktive sonetettheter sammenlignet med humanNMJs 4. I tillegg gjenspeiler legemiddelstudier utført i dyremodeller ikke alltid effektene som finnes i kliniske studier på mennesker. Konstruerte menneskelige vevsmodeller gir mulighet til å studere den sunne utviklingen av NMJ og patologien til nevromuskulære sykdommer og tillate narkotika screenings. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs)5 kan differensieres til en rekke celletyper, inkludert skjelettmuskelceller 6,7 og motoneuroner 8,9. hiPSCs kan enkelt genereres fra pasientceller, noe som muliggjør bedre sykdomsmodellering10 og medikamentscreening 11,12 gjennom pasientspesifikke vevsmodeller.
Todimensjonale (2D) monolags samkulturer av SKMs og MNs mangler morfologi, fenotype, organisasjon og funksjonell oppførsel av fysiologiske NMJs. NMJs dannes tilfeldig i 2D-kultur, som hemmer isoleringen av motorenheter for analyse, begrenser nøyaktige funksjonelle målinger og forhindrer bruk for gjentatte, systematiske eksperimenter13 . Tredimensjonale (3D) vevsmodeller av NMJ overvinner mange av disse begrensningene, og rekapitulerer de morfologiske og funksjonelle egenskapene til fysiologiske NMJs 7,14,15,16,17. Ved hjelp av denne modellen utvikles de to vevstypene separat og integreres deretter ved å styre aksonal vekst, slik at mer organiserte NMJ-er kan utvikle seg sammenlignet med 2D-kultursystemer.
Vår tidligere studie viste at kombinasjon av optogenetikk med vevsteknikk kan tillate nøyaktig ikke-invasiv stimulering og evaluering av NMJ-funksjon 18,19. Gjennom genteknologi kan lysfølsomme proteiner integreres i genomet til hiPSCs. Integrering av channelrhodopsin-2 (ChR2), en ionkanal som åpnes som svar på blått lys, inn i membranen til spennende celler som nevroner tillater ikke-kontakt spatiotemporal kontroll over celleaktivering 20,21,22. hiPSC-er som bærer ChR2 kan differensieres til optogenetiske motoneuroner som er følsomme for blått lys, noe som fjerner behovet for typiske invasive elektroder som stimulerer nevroner og unngår uønsket stimulering av muskelcellene med elektroder23. Dette systemet bruker optogenetiske motoneuroner for å stimulere sammentrekninger i ikke-optogenetiske skjelettmuskelceller. Ved å kombinere videoinnhenting og kontrollert blålysbelysning kan de samdyrkede vevene samtidig stimuleres og registreres for NMJ-funksjon.
MG er forårsaket av autoantistoffer rettet mot nikotin acetylkolinreseptorer (AChR), noe som resulterer i redusert NMJ-funksjon og muskel svakhet24. Det diagnostiseres basert på presenterte symptomer, elektrodiagnose og påvisning av autoantistoffer via serologiske blodprøver. Imidlertid er ikke alle autoantistoffer involvert i MG identifisert, og noen seronegative pasienter er diagnostisert med MG, men uten anerkjente antistoffer25,26. Vårt system muliggjør gjentatt funksjonsvurdering av NMJ før og etter tilsetning av serum fra MG-pasienter, noe som gir uvurderlig innsikt i de funksjonelle og biokjemiske endringene forårsaket av MG-antistoffene18. Vår protokoll illustrerer hvordan man produserer 3D in vitro-modeller av funksjonell human NMJ som kan brukes til å diagnostisere og undersøke NMJ-patologier og teste potensielle terapier. Vi demonstrerer allsidigheten til systemet i to plattformer, en mikrofluidisk enhet og en større bioreaktorplattform med åpen brønn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette systemet er en konstruert 3D menneskelig vevsmodell som kombinerer optogenetikk og videobehandling for å muliggjøre automatisert og upartisk evaluering av NMJ-funksjonen. Ved hjelp av en standardisert protokoll har vi vist evne til å måle endringer i NMJ-funksjon under fysiologisk utvikling og karakterisere de skadelige effektene av patologier som nevrotoksineksponering og myasthenia gravis patient sera.
Tidligere studier har rapportert evnen til å modellere MG med optogenetiske hPS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner takknemlig finansieringsstøtte fra NIH [tilskuddsnummer EB025765 og EB027062], DOD [tildelingsnummer W81XWH-18-1-0095] og UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Vi takker Columbia University Stem Cell Core for deres hjelp og veiledning med celle omprogrammering.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
Referências
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
- Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
- Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
- Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
- Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
- Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
- Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
- Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
- Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).
