Blodpladerig plasmalysats til behandling af øjenoverfladesygdomme

Summary

Trombocytlysater repræsenterer et nyt værktøj til behandling af okulære overfladesygdomme. Her foreslår vi en metode til fremstilling, dispensation, opbevaring og karakterisering af blodpladelysat indsamlet fra blodpladedonorer.

Abstract

Forskellige okulære overfladesygdomme behandles med blodafledte øjendråber. Deres anvendelse er blevet introduceret i klinisk praksis på grund af deres metabolit og vækstfaktorindhold, som fremmer øjenoverfladeregenerering. Blodbaserede øjendråber kan fremstilles fra forskellige kilder (dvs. fuldblods- eller blodpladeaferesedonation) samt med forskellige protokoller (f.eks. Forskellige fortyndinger og fryse-/optøningscyklusser). Denne variation hæmmer standardiseringen af kliniske protokoller og dermed evalueringen af deres kliniske virkning. Detaljering og deling af de metodologiske procedurer kan bidrage til at fastlægge fælles retningslinjer. I løbet af de sidste år har allogene produkter været diffuse som et alternativ til de autologe behandlinger, da de garanterer højere effektivitetsstandarder; blandt dem fremstilles det blodpladerige plasmalysat(PRP-L) øjendråber med enkle fremstillingsprocedurer. I transfusionsmedicinsk enhed på AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, opnås PRP-L ved blodplade-aferese donation. Dette produkt fortyndes oprindeligt til 0,3 x 10 9 blodplader/ml (startende fra en gennemsnitlig koncentration på 1 x 10 9 blodplader/ml) i^0,9% NaCl. Fortyndede blodplader fryses / optøes og centrifugeres derefter for at fjerne snavs. Det endelige volumen opdeles i 1,45 ml alikvoter og opbevares ved -80 °C. Før de udleveres til patienter, testes øjendråber for sterilitet. Patienter kan opbevare blodpladelysater ved -15 °C i op til 1 måned. Vækstfaktorsammensætningen vurderes også ud fra tilfældigt udvalgte alikvoter, og middelværdierne er rapporteret her.

Introduction

Blodafledte produkter anvendes i vid udstrækning i sårpleje¹, maxillofacial og ortopædkirurgi og til behandling af forskellige okulære overfladesygdomme² såsom tør øjensygdom (DED)³. I DED er tårefilmhomeostase nedsat som følge af den unormale funktion af forskellige faktorer, der er involveret i tåreproduktion og okulær overfladeintegritet ^4,5.

DED er karakteriseret ved heterogenitet i årsager og sværhedsgrad ^6,7,8 og kan være en konsekvens af forskellige faktorer som aldring, køn⁹, kontaktlinser^, topiske eller systemiske lægemidler 10 eller allerede eksisterende tilstande som Sjögrens syndrom ¹⁰. På trods af milde symptomer påvirker DED millioner af mennesker over hele verden og påvirker også deres livskvalitet og sundhedssystemet⁶.

Mange behandlinger er blevet rapporteret for denne patologi, men der er stadig ingen konsensus om den mest effektive løsning¹². Til dato er kunstige tårer den første terapilinje, der sigter mod at genoprette tårefilmens vandige sammensætning, omend disse substitutter ikke indeholder de vigtigste biologisk aktive opløste stoffer af naturlige tårer ^6,11. Trombocytbaserede produkter betragtes som et gyldigt alternativ^12,13 til kunstige tårer, selvom deres kliniske effektivitet^, anbefalinger til brug og fremstillingsmetoder stadig er et spørgsmål om debat³.

Blodbaserede produkter deler med tårer en lignende sammensætning med hensyn til metabolitter¹⁴, proteiner, lipider, vitaminer, ioner, vækstfaktorer (GF’er), antioxidantforbindelser 11 og osmolaritet (300 mOsm / L)¹¹. Gennem den synergistiske aktivitet af deres komponenter fremmer de regenerering af hornhindeepitelet, hæmmer frigivelsen af inflammatoriske cytokiner og øger antallet af bægerceller og ekspressionen af muciner i bindehinden ^2,3.

Indtil videre er heterogenitet i oftalmiske blodbaserede produkter blevet dokumenteret i litteraturen; Disse produkter kan klassificeres efter bloddonorernes oprindelse, dvs. autolog eller allogen, samt blodkilden, dvs. perifert blod, navlestrengsblod, serum eller blodplader.

Selvom autologe produkter var de mest udbredte³, bliver allogene nu det foretrukne valg, da de sikrer højere effektivitet og sikkerhedsstandarder 15 sammen med en betydelig reduktion i omkostninger^16,17. Tidligere undersøgelser har faktisk vist, at blodbaserede produkter fra patienter med autoimmune og/eller systemiske sygdomme kan vise ændret kvalitet og funktionalitet 6,16,17. På trods af at serumbaserede øjendråber er de mest udbredte, er blodpladebaserede produkter for nylig blevet bekræftet som et gyldigt alternativ, da de let kan tilberedes, samtidig med at der opretholdes betydelige effektivitetsniveauer ^3,11. Aktuelt tilgængelige blodpladebaserede produkter kan opdeles i blodpladerig plasma (PRP), blodpladerig plasmalysats (PRP-L) og plasma rig på vækstfaktorer (PRGF)³.

Blandt dem har PRP-L den fordel, at det er et frossent produkt med lang levetid. PRP-L kan fremstilles af aferese, buffy-coats eller endda fra udløbende blodplader (PLT’er)^18,19, hvilket dyrebart reducerer deres spild. Aliquoterne kan opbevares i månedsvis i blodtransfusionscentrene ved -80 °C eller endda i patienternes hjem ved -15 °C i kortere perioder.

PRP-L er meget beriget i GF’er, som har vist sig at stimulere øjenoverfladeregenerering 12,20,21. Ikke desto mindre er der kun få rapporterede kliniske undersøgelser på dette område, og alle brugte autologe kilder ^3,22. PRP-L har stadig brug for yderligere validering og karakterisering, før den rutinemæssigt kan bruges til behandling af øjenoverfladesygdomme, da der ikke er nogen standardiserede retningslinjer for forberedelse, dispensation og opbevaring³.

Heri deles en detaljeret protokol for produktion af PRP-L, der anvendes på Transfusion Medicine Unit i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, og dispensation til patienter med DED. Vi sigter mod at hjælpe det videnskabelige samfund med at udvikle standardmetoder til forberedelse, som kan øge homogeniteten og konsistensen i verdensomspændende undersøgelser og kliniske tilgange.

Protocol

PRP-L, der blev anvendt til kvantitativ vurdering af vækstfaktorer, blev indsamlet i en bredere undersøgelse af karakterisering af PRP-produkter til regenerative formål, udført på AUSL-IRCCS di Reggio Emilia og godkendt af Area Vasta Emilia Nord Ethical Committee den 10. januar 2019 (protokolnummer 2019/0003319). Donorerne gav deres informerede samtykke i henhold til Helsingforserklæringen. Ingen etisk godkendelse var nødvendig for at indsamle de aggregerede, anonyme data fra Ocular Surface Disease Index (OSDI) sp…

Representative Results

Begrundelsen for brugen af serumafledte øjendråber (som er det blodbaserede produkt, der oftest anvendes til behandling af øjenoverfladesygdomme) ligger i deres indhold af GF’er, som næsten fuldstændigt stammer fra cirkulerende blodplader. PRP indeholder et signifikant højere antal blodplader (og følgelig af blodpladeafledte GF’er) sammenlignet med perifert blodserum, der spænder mellem 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLT’er / ml. I henhold til italiensk lovgivning skal blodpladetallet i PRP-enheder …

Discussion

I de senere år er den kliniske anvendelse af blodpladebaserede produkter til okulære overfladepatologier steget, men deres diffusion hæmmes af manglen på videnskabelig robusthed. Dette skyldes hovedsagelig stor heterogenitet i donorkilder og forberedelsesprotokoller, som ofte ikke er fuldt ud offentliggjort eller ikke specifikt designet til det formål, som de udleveres til. Især mangler der stadig oplysninger om blodpladebaserede produkter indsamlet ved aferese. Formålet med dette arbejde var derfor at beskrive de…

Materials

Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected