Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis
Summary
Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.
Abstract
Het keldermembraan (BM) – een gespecialiseerd vel extracellulaire matrix aanwezig aan de basale kant van epitheelcellen – is van cruciaal belang voor de vaststelling en het onderhoud van epitheliale weefselmorfologie en orgaanmorfogenese. Bovendien is de BM essentieel voor weefselmodellering, dient het als een signaleringsplatform en biedt het externe krachten om weefsels en organen te vormen. Ondanks de vele belangrijke rollen die de BM speelt tijdens normale ontwikkeling en pathologische omstandigheden, zijn de biologische routes die de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes beheersen en hoe basale secretie leidt tot de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten slecht begrepen. Het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok is een uitstekend modelsysteem om de basale afzetting van BM-membraaneiwitten te bestuderen, omdat het alle belangrijke componenten van de BM produceert en afscheidt. Confocale en superresolutie beeldvorming in combinatie met beeldverwerking in vaste weefsels maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van cellulaire factoren die specifiek betrokken zijn bij de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het kleuren en afbeelden van BM-bevattende blaasjes en gedeponeerde BM met behulp van endogene gelabelde eiwitten in het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok . Dit protocol kan worden toegepast om zowel kwalitatieve als kwantitatieve vragen aan te pakken en het is ontwikkeld om high-throughput screening mogelijk te maken, waardoor factoren die betrokken zijn bij de gepolariseerde intracellulaire handel en afscheiding van blaasjes tijdens de ontwikkeling van epitheelweefsel mogelijk is.
Introduction
Het keldermembraan (BM) is een dunne plaat van gelaagde cel-adherente extracellulaire matrix (ECM) die cruciaal is voor de epithelstructuur en morfogenese1. Het bestaat uit ~ 50 eiwitten en wordt alomtegenwoordig aangetroffen onder de epitheel- en endotheelcellen, en verwarmt skelet-, gladde en hartspiercellen en adipocyten 1,2,3. De drie belangrijkste componenten van de BM aan de basale kant van de epitheelcellen zijn Collageen IV, Perlecan en Lamininen. De BM ligt ten grondslag aan de epitheelcellen en is verantwoordelijk voor vele functies, waaronder weefselscheiding en -barrière, groei en ondersteuning, en celpolarisatie 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Zijn rol als signaleringsplatform reguleert de morfologie en differentiatie van epitheelcellen en weefsels tijdens de ontwikkeling 3,13,14. Bovendien zijn de verkeerde regulatie van de BM en /of een schending van de integriteit ervan de primaire oorzaken van veel pathologische aandoeningen, waaronder tumormetastase 2,15,16. Ondanks de essentiële functies die de BM uitvoert tijdens weefsel- en orgaanmorfogenese, zijn de componenten van de biologische route (s) gewijd aan de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten vaag bekend.
Om de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes en de secretie van BM-eiwitten door epitheelcellen te bestuderen, is het folliculaire epitheel (FE) van de Drosophila-eierstok een krachtig modelsysteem (figuur 1). Een Drosophila-eierstok bestaat uit 16-20 lange, buisachtige structuren, ovarioles genaamd (figuur 1A, B)17,18,19. Elke ovariole kan worden gezien als een eierassemblagelijn, met de leeftijdsprogressie van eikamers (die elk aanleiding geven tot een ei) die begint aan het voorste uiteinde en achterste beweegt, totdat het rijpe ei door de eileider naar buiten komt. Elke eikamer wordt ingekapseld door de FE, een monolaag van somatische follikelcellen (FCs), die de centrale kiembaancellen (GC’s) omringt. De FE is sterk gepolariseerd met een duidelijke apicale-basale polariteit waarbij het apicale domein naar de kiembaan is gericht en de BM-eiwitten basaal worden uitgescheiden18,19. De VC’s scheiden actief alle belangrijke componenten van de BM af, waaronder Collagen IV, Perlecan en Laminins20,21. In epitheelcellen zoals FCs worden de BM-componenten geproduceerd en vereisen ze een gespecialiseerde gepolariseerde secretieroute voor hun afzetting extracellulair. Bijvoorbeeld, in het geval van de meest voorkomende component van de BM, Collageen IV (Coll IV), zijn de details rond de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie vaag, ondanks dat de productie en afzetting de focus is van veel studies. Coll IV wordt vertaald in het endoplasmatisch reticulum (ER), waar ook elk fibril – samengesteld uit drie polypeptiden (twee α1-ketens en één α2-keten) – wordt geassembleerd tot een drievoudige helix22. Een goede Coll IV-vouwing en -functie vereisen ER-chaperonnes en enzymen, waaronder lysyl- en prolyl-hydroxylasen zoals Plod en PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Deze posttranslationele enzymen reguleren de ER-sortering van Coll IV, omdat het verlies van elk ervoor zorgt dat Coll IV gevangen zit in de basale ER 20,23,24,25,26. Vervolgens verlaat nieuw gesynthetiseerde Coll IV de ER voor de Golgi in COPII-gecoate blaasjes. De ladingreceptor Tango1 helpt bij het verpakken van collageen in aanzienlijke Golgi-gebonden blaasjes die plaats bieden aan grote multimere eiwitten20,27. Zodra Coll IV is verpakt in intracellulaire exocytaire blaasjes, wordt het specifiek basaal uitgescheiden uit epitheelcellen. Om BM-afzetting naar de basale kant te leiden, hebben epitheelcellen een andere reeks factoren nodig die specifiek zijn gewijd aan gepolariseerde BM-secretie. Met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok zijn enkele componenten van dit nieuwe cellulaire proces gekarakteriseerd, waaronder de nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF’s) Crag en Stratum, de GTPases Rab8 en Rab10, evenals de niveaus van de fosfoinositide PI (4,5) P2 en Kinesine 1 en 3 motoreiwitten 20,28,29,30,31 . Deze componenten zijn van cruciaal belang voor de gepolariseerde verdeling van BM-eiwitten.
Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten in de FE te monitoren, kunnen endogene gelabelde keldermembraaneiwitten (eiwitvallen), zoals Viking-GFP (Vkg-GFP of α2 Coll IV-GFP) en Perlecan-GFP (Pcan-GFP) worden gebruikt 32,33. Van deze eiwitvallijnen is aangetoond dat ze de endogene verdeling van BM-eiwitten nauwkeurig weergeven en een gevoeligere detectie van vesiculaire handel mogelijk maken28,30. De componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM in de FE werden voor het eerst gekarakteriseerd met behulp van eiwitvallijnen voor Vkg-GFP en Pcan-GFP 20,28,29,30. Eiwitvallen kunnen worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutanten en Gal4-lijnen 34. Bovendien kunnen eiwitvallen worden gebruikt in combinatie met fluorescerende kleurstoffen en/of fluorescentie-immunostaining, waardoor een nauwkeurige karakterisering van de lokalisatie van BM-eiwitten mogelijk is bij het vergelijken van wildtype en mutante condities35.
Om de distributie en lokalisatie van BM-eiwitbevattende blaasjes nauwkeurig en efficiënt te beoordelen, vormen confocale laserscanmicroscopie (CLSM) en beeldvormingstechnieken met superresolutie een aanzienlijk voordeel voor andere beeldvormingsbenaderingen. Deze benaderingen koppelen beeldvorming met hoge resolutie aan relatief gebruiksgemak. CLSM is een microscopietechniek die een verbeterde optische resolutie mogelijk maakt door het monster met een laser te scannen op een rasterscanmanier met behulp van galvanometers. De opening van het gaatje is een kerncomponent van een confocale microscoop. Door de onscherpe signalen van boven of onder het brandpuntsvlak te blokkeren, resulteert het gaatje diafragma in een zeer superieure resolutie in de z-as36. Dit maakt het ook mogelijk om een reeks afbeeldingen in het z-vlak te verkrijgen, een z-stack genaamd, die overeenkomen met een reeks optische secties. z-stacks maken vervolgens een 3D-beeld van het specimen, via 3D-reconstructie, met behulp van beeldbewerkingssoftware. Conventionele epifluorescentie (widefield) microscopen, in tegenstelling tot confocale microscopen, zorgen ervoor dat onscherp licht bijdraagt aan de beeldkwaliteit, waardoor de beeldresolutie en het contrastmet 36,37 afnemen. Dit maakt epifluorescentiemicroscopie een minder aantrekkelijke kandidaat bij het bestuderen van eiwitlokalisatie of colocalisatie.
Hoewel CLSM een geschikte aanpak is voor verschillende toepassingen, waaronder beeldvorming en karakterisering van de intracellulaire handel in BM-eiwitten, vormt het nog steeds een probleem bij het afbeelden van monsters onder de diffractielimiet van Abbe van licht (200-250 nm). Bij het afbeelden van dergelijke monsters kan confocale microscopie, vooral bij gebruik van een olieobjectief, resulteren in een hoge resolutie. Superresolutietechnieken overschrijden echter de limiet van confocale microscopie. Er zijn verschillende benaderingen om superresolutiemicroscopie te bereiken, elk met specifieke resolutielimieten en elk geschikt voor verschillende analyses. Deze benaderingen omvatten foto-geïnactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED), gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en Airyscan (superresolutie) microscopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Hoewel Airyscan een grovere resolutie heeft dan PALM / STORM, STED en SIM, kan het nog steeds een resolutie van maximaal ~ 120 nm bereiken (ongeveer twee keer de resolutie van CLSM). Bovendien is aangetoond dat deze superresolutiemicroscopiebenadering een voordeel heeft ten opzichte van SIM- en andere superresolutietechnieken bij het afbeelden van dikke monsters en monsters met een lage signaal-ruisverhoudingvan 47,48.
Airyscan is een relatief nieuwe superresolutie confocale microscopietechnologie46. In tegenstelling tot traditionele CLSM’s, die de pinhole- en single point-detectors gebruiken om onscherp licht af te stoten, maakt deze superresolutiebenadering gebruik van een 32-kanaals galliumarsenidefosfide (GaAsP) fotomultiplicatorbuisgebieddetector die al het licht verzamelt op elke scanpositie45. Elk van de 32 detectoren werkt als een klein gaatje, waardoor de pinhole-grootte wordt verkleind van de traditionele 1.0 Airy Unit (A.U.) tot een verbeterde 0.2 A.U., waardoor een nog hogere resolutie en signaal-ruisverhouding mogelijk is, met behoud van de efficiëntie van een 1.25 A.U. diameter45. Bovendien resulteert de lineaire deconvolutie die Airyscan gebruikt in een tot 2x hogere resolutie45. Dit in aanmerking nemend, zijn CLSM, en specifiek superresolutiemicroscopie, zeer geschikt om BM-eiwitten en eiwitten te bestuderen die de basale afzetting van BM-eiwitten reguleren, omdat ze afbeeldingen met een zeer hoge resolutie kunnen produceren voor lokalisatie- en colokalisatiestudies, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de ruimtelijke, temporele en moleculaire gebeurtenissen die deze processen beheersen.
Een alternatieve benadering van confocale microscopie die kan worden gebruikt om lokalisatie-experimenten uit te voeren, is beelddeconvolutie. Aangezien widefield-microscopie het mogelijk maakt om onscherp licht de detectoren te bereiken, kunnen wiskundige en computationele deconvolutie-algoritmen worden toegepast om onscherp licht uit beelden verkregen door widefield-microscopie te verwijderen of opnieuw toe te wijzen, waardoor de resolutie en het contrast van het beeld worden verbeterd49. Deconvolutie-algoritmen kunnen ook worden toegepast op confocale beelden om de resolutie en het contrast verder te verhogen, waardoor uiteindelijke beelden worden geproduceerd die bijna vergelijkbaar zijn met die van superresolutiemicroscopie50. Airyscan maakt gebruik van Weiner filter-gebaseerde deconvolutie samen met Sheppard’s pixel hertoewijzing, wat resulteert in een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding. Vergeleken met confocale microscopie wordt een toename van 2x in resolutie in alle drie de ruimtelijke dimensies (120 nm in x en y en 350 nm in z) waargenomen bij gebruik van deze superresolutiemicroscopietechniek45,51.
Dit manuscript biedt gedetailleerde en geoptimaliseerde protocollen om de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten te kleuren, te verwerven en te visualiseren met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok als een modelsysteem in combinatie met confocale en superresolutiemicroscopie. Drosophila-lijnen die endogene gelabelde keldermembraaneiwitten tot expressie brengen, bijvoorbeeld Vkg-GFP en Pcan-GFP, zijn efficiënte en nauwkeurige hulpmiddelen om BM-eiwithandel en -secretie te visualiseren. Bovendien kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutant en Gal4 / UAS-lijnen 34. Hoewel endogeen gelabelde keldermembraaneiwitten worden aanbevolen, is het gebruik van antilichamen tegen specifieke BM-eiwitten ook compatibel met de beschreven protocollen. Deze protocollen zijn vooral nuttig voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van intracellulaire handel en de secretie van BM-eiwitten in intact epitheelweefsel met behulp van confocale en superresolutie beeldvorming. Bovendien maakt de mogelijkheid om epitheliale weefselanalyse te combineren met de uitgebreide hulpmiddelen van Drosophila genetica deze aanpak bijzonder krachtig. Ten slotte kunnen deze protocollen eenvoudig worden aangepast om de vesiculaire handel en het sorteren van andere interessante eiwitten te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De BM is van cruciaal belang voor embryonale en orgaanmorfogenese en fysiologische functies bij volwassenen. Bovendien fungeert de BM als een signaleringsplatform voor het vaststellen en onderhouden van epitheliale polariteit en biedt weefsels ondersteuning2. Toch zijn de mechanismen die de juiste plaatsing van BM-eiwitten reguleren slecht begrepen. Een beter begrip van de biologische routes gewijd aan de intracellulaire handel en gepolariseerde secretie van BM-eiwitten vereist een zorgvuldige ana…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn Julie Merkle dankbaar voor haar nuttige commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R15GM137236 aan O.D. De confocale en superresolutiebeelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 900 met Airyscan 2, gekocht met NSF MRI-subsidie 2018748.
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
Referências
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
- Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
- Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
- Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
- Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
- Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
- Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
- Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
- Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
- Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
- Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
- Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), 3805-3815 (2006).
- Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
- Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
- Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
- Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Biologia do Desenvolvimento. 227 (2), 690-705 (2000).
- Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
- Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
- Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
- Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
- Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
- Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genética. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genética. 201 (3), 815-842 (2015).
- Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genética. 211 (1), 15-34 (2019).
- Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
- Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
- Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
- Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, 111-130 (2021).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
- Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
- Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
- He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
- Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, 21-28 (2015).
- Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genética. 208 (1), 1-18 (2018).
