Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Summary

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Abstract

Die Basalmembran (BM) – ein spezialisiertes Blatt extrazellulärer Matrix, das auf der Basalseite von Epithelzellen vorhanden ist – ist entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Epithelgewebemorphologie und Organmorphogenese. Darüber hinaus ist das BM für die Gewebemodellierung unerlässlich, dient als Signalplattform und liefert externe Kräfte, um Gewebe und Organe zu formen. Trotz der vielen wichtigen Rollen, die die BM während der normalen Entwicklung und der pathologischen Zustände spielt, sind die biologischen Wege, die den intrazellulären Transport von BM-haltigen Vesikeln kontrollieren und wie die basale Sekretion zur polarisierten Ablagerung von BM-Proteinen führt, kaum verstanden. Das follikuläre Epithel des Drosophila-Eierstocks ist ein hervorragendes Modellsystem, um die basale Ablagerung von BM-Membranproteinen zu untersuchen, da es alle wichtigen Komponenten des BM produziert und absondert. Konfokale und hochauflösende Bildgebung in Kombination mit Bildverarbeitung in festsitzenden Geweben ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung zellulärer Faktoren, die spezifisch am intrazellulären Transport und der Ablagerung von BM-Proteinen beteiligt sind. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Färbung und Bildgebung von BM-haltigen Vesikeln und abgelagerten BM unter Verwendung von endogen markierten Proteinen im Follikeliphel des Drosophila-Eierstocks vor. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um sowohl qualitative als auch quantitative Fragen zu beantworten, und es wurde entwickelt, um Hochdurchsatz-Screening zu ermöglichen, was die schnelle und effiziente Identifizierung von Faktoren ermöglicht, die am polarisierten intrazellulären Transport und der Sekretion von Vesikeln während der Entwicklung des Epithelgewebes beteiligt sind.

Introduction

Die Basalmembran (BM) ist eine dünne Schicht aus geschichteter zelladhärenter extrazellulärer Matrix (ECM), die für die Epithelstruktur und Morphogenese 1 entscheidend^ist. Es besteht aus ~ 50 Proteinen und wird ubiquitär unter den Epithel- und Endothelzellen gefunden und umhüllt Skelett-, Glatt- und Herzmuskelzellen^und Adipozyten ^1,2,3. Die drei Hauptkomponenten des BM an der Basalseite der Epithelzellen sind Kollagen IV, Perlecan und Laminine. Das BM liegt den Epithelzellen zugrunde und ist für viele Funktionen verantwortlich, einschließlich Gewebetrennung und -barriere, Wachstum und Unterstützung sowie Zellpolarisation 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Seine Rolle als Signalplattform reguliert die Morphologie und Differenzierung von Epithelzellen und -geweben während der Entwicklung 3,13,14. Darüber hinaus sind die Fehlregulation des BM und / oder eine Verletzung seiner Integrität die Hauptursachen für viele pathologische Zustände, einschließlich Tumormetastasen ^2,15,16. Trotz der wesentlichen Funktionen, die das BM während der Gewebe- und Organmorphogenese ausführt, sind die Bestandteile der biologischen Signalwege, die dem polarisierten intrazellulären Transport und der Sekretion von BM-Proteinen gewidmet sind, vage bekannt.

Um den intrazellulären Transport von BM-haltigen Vesikeln und die Sekretion von BM-Proteinen durch Epithelzellen zu untersuchen, ist das follikuläre Epithel (FE) des Drosophila-Eierstocks ein leistungsfähiges Modellsystem (Abbildung 1). Ein Drosophila-Eierstock besteht aus 16-20 langen, röhrenartigen Strukturen, die als Ovariolen bezeichnet werden (Abbildung 1A,B)^17,18,19. Jede Eizelle kann als ein Eierfließband betrachtet werden, mit dem Altersverlauf der Eikammern (die jeweils ein Ei entstehen lassen), das am vorderen Ende beginnt und sich nach hinten bewegt, bis das reife Ei durch den Eileiter austritt. Jede Eizellkammer wird von der FE eingekapselt, einer Monoschicht aus somatischen Follikelzellen (FCs), die die zentralen Keimbahnzellen (GCs) umgibt. Die FE ist stark polarisiert mit einer ausgeprägten apikal-basalen Polarität, bei der die apikale Domäne der Keimbahn zugewandt ist und die BM-Proteine basal^18,19 sezerniert werden. Die FCs sezernieren aktiv alle Hauptkomponenten des BM, einschließlich Kollagen IV, Perlecan und Laminine^20,21. In Epithelzellen wie FCs werden die BM-Komponenten hergestellt und benötigen für ihre extrazelluläre Abscheidung einen spezialisierten polarisierten Sekretionsweg. Zum Beispiel sind im Fall der am häufigsten vorkommenden Komponente des BM, Collagen IV (Coll IV), die Details rund um seinen polarisierten intrazellulären Verkehr und seine Sekretion vage, obwohl seine Produktion und Ablagerung im Mittelpunkt vieler Studien stehen. Coll IV wird in das endoplasmatische Retikulum (ER) übersetzt, wo auch jede Fibrille – bestehend aus drei Polypeptiden (zwei α1-Ketten und einer α2-Kette) – zu einer Dreifachhelix²² zusammengesetzt ist. Die richtige Koll IV-Faltung und -Funktion erfordern ER-Chaperone und Enzyme, einschließlich Lysyl^– und Prolyl-Hydroxylasen wie Plod und PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Diese posttranslationalen Enzyme regulieren die ER-Sortierung von Coll IV, da der Verlust jedes einzelnen dazu führt, dass Coll IV im basalen ER 20,23,24,25,26 gefangen ist. Dann verlässt neu synthetisiertes Coll IV die Notaufnahme für den Golgi in COPII-beschichteten Vesikeln. Der Frachtrezeptor Tango1 hilft beim Verpacken von Kollagenen in beträchtliche Golgi-gebundene Vesikel, die große multimere Proteine aufnehmen können^20,27. Sobald Coll IV in intrazelluläre exozytäre Vesikel verpackt ist, wird es spezifisch basal aus Epithelzellen sezerniert. Um die BM-Ablagerung auf die Basalseite zu lenken, benötigen Epithelzellen einen weiteren Satz von Faktoren, die speziell für die polarisierte BM-Sekretion bestimmt sind. Unter Verwendung der FE des Drosophila-Eierstocks wurden einige Komponenten dieses neuartigen zellulären Prozesses charakterisiert, darunter die Nukleotidaustauschfaktoren (GEFs) Crag und Stratum, die GTPasen Rab8 und Rab10 sowie die Spiegel des Phosphoinositids PI(4,5)P2 und der Kinesin 1 und 3 Motorproteine 20,28,29,30,31 . Diese Komponenten sind entscheidend für die Sicherstellung der polarisierten Verteilung von BM-Proteinen.

Um die intrazelluläre Lokalisation von BM-Proteinen in der FE zu überwachen, können endogen markierte Basalmembranproteine (Proteinfallen) wie Viking-GFP (Vkg-GFP oder α2 Coll IV-GFP) und Perlecan-GFP (Pcan-GFP) verwendet^{werden 32,33}. Es wurde gezeigt, dass diese Proteinfallenlinien die endogene Verteilung von BM-Proteinen genau widerspiegeln und einen empfindlicheren Nachweis des vesikulären Verkehrs ermöglichen ^28,30. Die Komponenten, die an der polarisierten Abscheidung von BM in der FE beteiligt sind, wurden zunächst mit Hilfe von Proteinfallenlinien für Vkg-GFP und Pcan-GFP^20,28,29,30 charakterisiert. Proteinfallen können in verschiedenen genetischen Hintergründen verwendet werden, einschließlich Mutanten und Gal4-Linien ³⁴. Darüber hinaus können Proteinfallen in Kombination mit fluoreszierenden Farbstoffen und/oder Fluoreszenzimmunfärbung verwendet werden, was eine präzise Charakterisierung der Lokalisation von BM-Proteinen beim Vergleich von Wildtyp- und Mutantenbedingungen^{ermöglicht 35}.

Um die Verteilung und Lokalisation von BM-proteinhaltigen Vesikeln genau und effizient beurteilen zu können, stellen konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) und hochauflösende Bildgebungsverfahren einen wesentlichen Vorteil gegenüber anderen bildgebenden Verfahren dar. Diese Ansätze koppeln hochauflösende Bildgebung mit relativer Benutzerfreundlichkeit. CLSM ist eine Mikroskopietechnik, die eine verbesserte optische Auflösung ermöglicht, indem die Probe mit einem Laser in Rasterscan-Manier mit Galvanometern abgetastet wird. Die Lochblende ist eine Kernkomponente eines konfokalen Mikroskops. Durch das Blockieren der unscharfen Signale, die von oberhalb oder unterhalb der Brennebene kommen, führt die Lochblende zu einer sehr überlegenen Auflösung in der z-Achse³⁶. Dies ermöglicht es auch, eine Reihe von Bildern in der z-Ebene zu erhalten, die als Z-Stack bezeichnet wird und einer Reihe von optischen Schnitten entspricht. z-stacks erstellen anschließend ein 3D-Bild der Probe per 3D-Rekonstruktion mit Hilfe von Bildgebungssoftware. Herkömmliche Epifluoreszenzmikroskope (Weitfeldmikroskope) ermöglichen im Gegensatz zu konfokalen Mikroskopen, dass unscharfes Licht zur Bildqualität beiträgt und die Bildauflösung und den Kontrast verringert^36,37. Dies macht die Epifluoreszenzmikroskopie zu einem weniger attraktiven Kandidaten bei der Untersuchung der Proteinlokalisation oder -kolokalisation.

Obwohl CLSM ein geeigneter Ansatz für verschiedene Anwendungen ist, einschließlich der Bildgebung und Charakterisierung des intrazellulären Transports von BM-Proteinen, stellt es immer noch ein Problem dar, wenn Proben unterhalb der Beugungsgrenze von Abbe des Lichts (200-250 nm) abgebildet werden. Bei der Abbildung solcher Proben kann die konfokale Mikroskopie, insbesondere bei Verwendung eines Ölobjektivs, zu einer hohen Auflösung führen. Super-Resolution-Techniken überschreiten jedoch die Grenze der konfokalen Mikroskopie. Es gibt verschiedene Ansätze, um eine hochauflösende Mikroskopie zu erreichen, die jeweils spezifische Auflösungsgrenzen aufweisen und jeweils für unterschiedliche Analysen geeignet sind. Zu diesen Ansätzen gehören die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) oder die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), die stimulierte Emissionsdeplementierungsmikroskopie (STED), die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) und die Airyscan (Superauflösung) Mikroskopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Obwohl Airyscan eine gröbere Auflösung als PALM / STORM, STED und SIM hat, kann es immer noch eine Auflösung von bis zu ~ 120 nm (etwa doppelt so hoch wie CLSM) erreichen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass dieser hochauflösende Mikroskopieansatz einen Vorteil gegenüber SIM und anderen hochauflösenden Techniken hat, wenn dicke Proben und Proben mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis^47,48 abgebildet werden.

Airyscan ist eine relativ neue hochauflösende konfokale Mikroskopie-Technologie⁴⁶. Im Gegensatz zu herkömmlichen CLSMs, die die Pinhole- und Einzelpunktdetektoren verwenden, um unscharfes Licht abzulehnen, verwendet dieser superauflösende Ansatz einen 32-Kanal-Galliumarsenid-Phosphid (GaAsP) Photomultiplier-Röhrenflächendetektor, der das gesamte Licht an jeder Scanposition⁴⁵ sammelt. Jeder der 32 Detektoren arbeitet als kleines Loch und reduziert die Lochgröße von der traditionellen 1.0 Airy Unit (A.U.) auf eine verbesserte 0,2 A.U., was eine noch höhere Auflösung und ein noch höheres Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht, während die Effizienz eines Durchmessers von 1,25 A^{A 45} beibehalten wird. Darüber hinaus führt die von Airyscan verwendete lineare Dekonvolution zu einer bis zu^2-fachen Erhöhung der Auflösung 45. In Anbetracht dessen sind CLSM und insbesondere die hochauflösende Mikroskopie gut geeignet, um BM-Proteine und Proteine zu untersuchen, die die basale Ablagerung von BM-Proteinen regulieren, da sie sehr hochauflösende Bilder für Lokalisierungs- und Kolokalisierungsstudien liefern können und dadurch neue Einblicke in die räumlichen, zeitlichen und molekularen Ereignisse liefern, die diese Prozesse steuern.

Ein alternativer Ansatz für die konfokale Mikroskopie, der zur Durchführung von Lokalisierungsexperimenten verwendet werden kann, ist die Bilddekonvolution. Da die Weitfeldmikroskopie es ermöglicht, dass unscharfes Licht die Detektoren erreicht, können mathematische und rechnerische Dekonvolutionsalgorithmen angewendet werden, um unscharfes Licht aus Bildern zu entfernen oder neu zuzuweisen, die durch Weitfeldmikroskopie erhalten wurden, wodurch die Auflösung und der Kontrast des Bildes^{verbessert werden 49}. Dekonvolutionsalgorithmen können auch auf konfokale Bilder angewendet werden, um die Auflösung und den Kontrast weiter zu erhöhen, wodurch endgültige Bilder erzeugt werden, die fast mit denen der hochauflösenden Mikroskopie⁵⁰ vergleichbar sind. Airyscan nutzt die weiner-filterbasierte Dekonvolution zusammen mit Sheppards Pixelneuzuweisung, was zu einer stark verbesserten räumlichen Auflösung und einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis führt. Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie wird bei Verwendung dieser hochauflösenden Mikroskopietechnik eine Erhöhung der Auflösung um das 2-fache in allen drei räumlichen Dimensionen (120 nm in x und y und 350 nm in z) beobachtet ^45,51.

Dieses Manuskript bietet detaillierte und optimierte Protokolle zur Färbung, Erfassung und Visualisierung des intrazellulären Transports und der Ablagerung von BM-Proteinen unter Verwendung der FE des Drosophila-Eierstocks als Modellsystem in Verbindung mit konfokaler und hochauflösender Mikroskopie. Drosophila-Linien , die endogen markierte Basalmembranproteine exprimieren, z. B. Vkg-GFP und Pcan-GFP, sind effiziente und genaue Werkzeuge zur Visualisierung des BM-Proteintransports und der Sekretion. Darüber hinaus können sie problemlos in verschiedenen genetischen Hintergründen verwendet werden, einschließlich Mutanten- und Gal4 / UAS-Linien ³⁴. Obwohl endogen markierte Basalmembranproteine empfohlen werden, ist die Verwendung von Antikörpern gegen spezifische BM-Proteine auch mit den beschriebenen Protokollen kompatibel. Diese Protokolle sind besonders nützlich für Wissenschaftler, die daran interessiert sind, den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen in intaktem Epithelgewebe mittels konfokaler und hochauflösender Bildgebung zu untersuchen. Darüber hinaus macht die Fähigkeit, die epitheliale Gewebeanalyse mit den expansiven Werkzeugen der Drosophila-Genetik zu kombinieren, diesen Ansatz besonders leistungsfähig. Schließlich könnten diese Protokolle leicht angepasst werden, um den vesikulären Transport und die Sortierung anderer interessanter Proteine zu untersuchen.

Protocol

1. Fliegenvorbereitung für Eierstockdissektionen Geben Sie 10-15 Drosophila melanogaster weibliche Fliegen (1-2 Tage alt) des gewünschten Genotyps in eine schmale Durchstechflasche mit ~ 8 ml Drosophila-Fliegenmedium , die 2-3 Tage vor der Dissektion bei 25 ° C mit einer kleinen Menge granulierter Bäckerhefe bestreut wurde. Das Hinzufügen einiger Männchen zur Durchstechflasche kann den Eizellenertrag steigern. Stellen Sie jedoch sicher, dass die Gesamtzahl der Fliegen 2…

Representative Results

Die hierin beschriebenen Methoden können verwendet werden, um den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen in polarisierten Epithelzellen, wie der FE des Drosophila-Eierstocks , effizient und genau abzubilden und zu charakterisieren. Als nächstes liefern wir erwartete Ergebnisse, die mit den beschriebenen Methoden erzielt wurden, sowie hilfreiche Ratschläge und mögliche Fallstricke. Dazu wird Vkg-GFP, ein endogen getaggtes Vkg (Drosophila Col IV), verwendet. Die gleichen Ergebni…

Discussion

Die BM ist entscheidend für die embryonale und Organmorphogenese sowie die physiologischen Funktionen von Erwachsenen. Darüber hinaus fungiert das BM als Signalisierungsplattform für die Etablierung und Aufrechterhaltung der epithelialen Polarität und versorgt Gewebe mit Unterstützung². Die Mechanismen, die die richtige Platzierung von BM-Proteinen regulieren, sind jedoch kaum verstanden. Ein besseres Verständnis der biologischen Signalwege, die dem intrazellulären Transport und der polaris…

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing