Denne protokollen beskriver ekstraksjon av ikke-proteinaminosyrer fra biologiske matriser via trikloreddiksyre (TCA) proteinutfelling og syrehydrolyse før analyse ved bruk av væskekromatografi-tandem massespektrometri.
Ikke-protein aminosyrer (NPAA) er en stor klasse aminosyrer (AA) som ikke er genetisk kodet for oversettelse til proteiner. Analysen av NPAA kan gi viktig informasjon om cellulært opptak og / eller funksjon, metabolske veier og potensiell toksisitet. β-metylamino-L-alanin (BMAA) er en nevrotoksisk NPAA produsert av ulike algerarter og er forbundet med økt risiko for nevrodegenerative sykdommer, noe som har ført til betydelig forskningsinteresse. Det er mange måter å trekke ut AA for analyse, med væskekromatografi-tandem massespektrometri som den vanligste, og krever proteinutfelling etterfulgt av syrehydrolyse av proteinpelleten. Studier av tilstedeværelsen av BMAA hos algearter gir motstridende resultater, med bruk av ikke-validert prøvepreparering / ekstraksjon og analyse som en primær årsak. Som de fleste NPAAer er proteinutfelling i 10% vandig TCA og hydrolyse med fuming HCl den mest hensiktsmessige form for ekstraksjon for BMAA og dets isomerer aminoetylglycin (AEG) og 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). Denne protokollen beskriver trinnene i en validert NPAA-ekstraksjonsmetode som vanligvis brukes i forsknings- og undervisningslaboratorier.
Aminosyrer er kjemiske forbindelser som inneholder minst en amin- og karboksylfunksjonell gruppe. Noen aminosyrer inneholder også en iminogruppe, en annen funksjonell syregruppe enn karboksylsyre; Andre aminosyrer har amingrupper som ikke er festet til α-karbongruppe1. Det er over 500 aminosyrer2, hvorav 22 er kjent som proteinaminosyrer som brukes til genetisk koding i ribosomal proteinsyntese3. Disse 22 aminosyrene kan videre deles inn i essensielle og ikke-essensielle. Essensielle aminosyrer er nødvendige for at kroppen skal fungere skikkelig og kan bare kjøpes av eksterne kilder. Ikke-essensielle aminosyrer kan syntetiseres i organismen. Klassifiseringen av de 22 aminosyrene i essensielle/ikke-essensielle er unik for enkeltarter. Alle andre aminosyrer er ikke-protein aminosyrer (NPAA) som ikke er kodet for proteinsyntese. Aminosyrer, enten protein eller ikke-protein, kan også spille en signalrolle i en organisme og fungere som metabolske mellommenn4. På grunn av deres viktige og varierende roller kan aminosyrenivåer gi et innblikk i organismens tilstand, funksjonalitet og metabolske veier, etc. Det er to hovedmekanismer ved hvilke aminosyrer kan inkorporeres i en polypeptidkjede: ribosomal proteinsyntese, som benytter de 22 aminosyrene i koding, og ikke-ribosomal peptidsyntese, som sammen med proteinaminosyrer tillater bruk av noen NPAA i syntese. Visse NPAA kan etterligne proteinaminosyrer, noe som potensielt fører til feilinkorporering i peptider og proteiner. Feilinkorporeringen forårsaker en feilfolding av proteiner, som igjen har skadelige effekter5, for eksempel feilinkorporering av NPAA L-3,4 dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) i stedet for tyrosin, som negativt påvirker cellulær funksjon og helse 6,7. En ekstra kilde til innlemmede NPAA er gjennom posttranslasjonell modifikasjon (PTM) av aminosyrerester. Aminosyrerester modifiseres av ulike årsaker, inkludert endringer i peptid- eller proteinkonformasjon, stabilitet og funksjonalitet. Ved hydrolyse av PTM-holdig protein eller peptider frigjøres disse modifiserte aminosyrerestene i deres frie NPAA-form 8,9.
NPAA β-metylamino-L-alanin (BMAA) produsert av cyanobakterier, kiselalger og dinoflagellater10 er et mistenkt nevrotoksin som er involvert som en medvirkende faktor til ulike nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose / parkinsonisme-demenskompleks (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateral sklerose og Alzheimers sykdom 13 . Det foreslås at BMAA feilaktig inkorporeres i polypeptidkjeden av proteiner i stedet for L-serin14 og / eller andre proteinaminosyrer. Feilinkorporering av BMAA kan føre til feilfolding av proteiner, noe som resulterer i avsetning av proteinaggregater i nevroner14. I det siste tiåret har interessen for BMAA økt betydelig. Et bredt spekter av cyanobakterielle arter fra ferskvann, marine og brakkvannsmiljøer har blitt oppdaget for å produsere BMAA15, noe som fører til deres utbredte distribusjon i ulike økosystemer16,17. I tillegg har BMAA vist seg å biomagnifisere gjennom næringskjeden til den menneskelige matbanen18,19. På grunn av de potensielle helseeffektene, mangel på forståelse og inkongruenser av BMAA-toksisitet, er det viktig å fortsette videre forskning til enten toksisiteten til BMAA til slutt forstås eller BMAA anses som trygg20,21.
Analysen av aminosyrer i biologiske prøver kan deles inn i fire hovedtrinn: prøvepreparering, aminosyrederivatisering, separasjon og deteksjon, og identifikasjon og kvantifisering. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) er den foretrukne analysemetoden, da den gir en målrettet og reproduserbar separasjon og analyse av aminosyrer.
Prøveprepareringsteknikker for analyse av cyanobakterielle og andre algeprøver involverer hovedsakelig en ekstraksjonsmetode for aminosyrer i deres frie og proteinbundne former. Gjennom årene har ekstraksjonsmetodene holdt seg relativt konsistente med vanlige elementer, inkludert oppløsning av prøven for å skille de frie aminosyrene fra deres bundne form, etterfulgt av proteinutfelling og frigjøring av de bundne aminosyrene gjennom hydrolyse med saltsyre (HCl) ved forhøyede temperaturer22 . Denne ekstraksjonsformen er optimalisert for proteinaminosyrer og brukes til NPAA. Imidlertid har deteksjon og kvantifisering av BMAA og dets isomerer (figur 1), aminoetylglycin (AEG) og 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB), i samme art av cyanobakterier vist inkonsekvente resultater i litteraturen, med en mulig forklaring som ligger i forskjeller i vekstforholdene og / eller stammen av alger som produserer varierende eller ingen mengder BMAA23 . Det har blitt hevdet at en mer sannsynlig forklaring på inkonsekvensene i deteksjon og kvantifisering av BMAA og dets isomerer skyldes ikke-validerte eksperimentelle protokoller, bruk av et bredt spekter av analytiske teknikker og utilstrekkelig eksperimentell detalj i de rapporterte metodene16,24 som fører til irreproduserbare interlaboratoriedata. Glover et al.25 og Banack 26 har imidlertid nylig utviklet og validert en analytisk teknikk for påvisning og kvantifisering av BMAA og dets isomerer ved bruk av ultra-performance væskekromatografi (UPLC) -MS / MS i samsvar med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia og FDA-retningslinjer som er nødvendige for enkeltlaboratorievalidering.
Disse valideringseksperimentene fokuserte på separasjon og påvisning av BMAA og dets isomerer og adresserte ikke inkonsekvensene i prøveprepareringsprotokoller. Lage et al.27 sammenlignet ytelsen til tre vanlige ekstraksjonsmetoder for å kvantifisere BMAA og dets isomerer i cyanobakterielle prøver via LC-MS / MS: fastfaseekstraksjon (SPE) av frie aminosyrer28,29; en proteinutfellingsmetode som involverer en metanolekstraksjon og acetonutfelling30; og den mest brukte ekstraksjonsmetoden for BMAA, proteinutfelling med trikloreddiksyre (TCA)31. De konkluderte med at TCA-proteinutfelling var den optimale protokollen, noe som ga høyere BMAA-konsentrasjoner i testprøvene sammenlignet med de andre ekstraksjonsmetodene. Deres studie validerte TCA-ekstraksjon med derivatisering av BMAA ved bruk av 6-aminoquinolyl-N-hydroksysuccinimidylkarbamat (AQC) i en cyanobakteriematrise, og ga en etablert veiledning for å oppnå pålitelige og reproduserbare BMAA-data. TCA-aminosyreekstraksjon er en akseptert og vanlig prøveprepareringsteknikk som også kan brukes på andre matriser. Imidlertid må stabiliteten til aminosyren under hydrolyse vurderes for å forhindre nedbrytning eller oksidasjon, som kan overvinnes ved bruk av kjemiske modifikatorer og reduksjonsmidler32. TCA-ekstraksjon brukes rutinemessig og læres til nye forskerstuderende, og selv om protokollen er mye rapportert, er et visuelt hjelpemiddel i anvendelsen av denne metoden en verdifull ressurs, noe som sikrer riktig og konsekvent utførelse.
Omvendt fasekromatografi brukes ofte til å separere aminosyrer, noe som krever et derivatiseringstrinn før analyser. Derivasjonen av aminosyrer som BMAA tillater kromatografisk retensjon og kan øke oppløsningen mellom isomerer. Det øker også molekylmassen og forbedrer ioniseringen i massespektrometeret. Flere derivatiserende reagenser har blitt brukt til analyse av aminosyrer via LC-MS / MS, inkludert propylkloroformat (PCF) 33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC) 27, 9-fluorenylmetylkloroformat (FMOC) 34 og dansylklorid (DC) 35. Imidlertid brukte de eneste validerte teknikkene for å analysere BMAA enten PCF 36 eller AQC24,26,37 som deres derivatiserende reagens.
Omfanget av denne protokollen er fokusert på TCA-ekstraksjon av NPAAer fra cyanobakterielle matriser. Det er en arbeidsintensiv metode som rutinemessig brukes og undervises i akademiske og industrielle forskningslaboratorier basert på manuskripter som kan være korte på detaljer; Derfor gir denne protokollen detaljer om prosedyren og teknikkene som er involvert i å forberede prøver for analyse av fri og bundet BMAA som modellaminosyre.
Ekstraksjonsprotokollen som er skissert her for analyse av NPAAer, gjelder for analyse av aminosyrer i biologiske prøver. For veiledninger om isolering og dyrking av cyanobakterielle stammer kan man referere til metodene presentert i studien til Violi et al.38. Det første trinnet i protokollen tar prøven til et punkt der normalisering mellom prøver mot tørrvekten kan oppnås. Det andre trinnet er cellelyse for å frigjøre analyttene og kan utføres ved hjelp av en rekke teknikker, inkludert mekaniske forstyrrelser / lyser som sondesonikering som beskrevet i denne protokollen, fryse / tine sykluser, sliping og perlefresing og ikke-mekaniske forstyrrelser som enzymatisk, vaskemiddel og / eller kjemisk lyse. Mekanisk forstyrrelse er kjent for å være fordelaktig i forhold til ikke-mekanisk, da det muliggjør større kapasitet i prøven til lyse samtidig som de intracellulære bindingene og proteinene forblir intakte41, selv om prøvematrisen kan diktere den optimale metoden for cellelysing.
Proteinutfelling er det kritiske tredje trinnet i denne protokollen når man trekker ut aminosyrer for analyse. TCA er det mest brukte løsningsmidlet; Imidlertid har perklorsyre, aceton, metyl-tert-butyleter (MTBE), metanol og / eller acetonitril 8,42 også blitt brukt, hvor hvert ekstraksjonsløsningsmiddel er ment å trekke ut og utfelle forskjellige substrater. Modellen beskrevet her trekker ut NPAA BMAA og dets isomerer fra en cyanobakteriell matrise, og selv om en rekke forskjellige løsningsmidler har blitt brukt, er de to vanligste 10% TCA i vann (vandig) og 10% TCA i aceton. Generelt brukes proteinutfelling med TCA ofte til å trekke ut aminosyrer for å fraksjonere frie aminosyrer fra proteinbundne aminosyrer. I tillegg tillater TCA-ekstraksjon å bestemme det totale proteininnholdet, redusere forurensninger for den frie fraksjonen og redusere aktiviteten til proteaser med minimal proteinnedbrytning43. TCA-ekstraksjonen av den frie fraksjonen virker ved først å skylle ut organisk løselige stoffer, etterlate proteiner og uoppløselige forbindelser som celleveggrester i bunnfallet, som deretter etterfølges av termisk hydrolyseekstraksjon av proteinbundne aminosyrer (bundet fraksjon) ved bruk av en sterk syre.
Fraksjoneringen av den frie fraksjonen med 10% vandig TCA pluss sonikering gir den mest omfattende proteinutfellingen sammenlignet med andre organiske løsningsmidler44 og de beste aminosyreutvinningene42. Noen studier velger å bruke en syre kombinert med et organisk løsningsmiddel (dvs. 10% -20% TCA i aceton 43) for å utfelle flere molekyler, inkludert mindre peptider / biomolekyler, minimere proteinnedbrytning og redusere forurensninger som salter43. En annen fordel med 10% TCA i aceton er dens raskere tørkehastighet ved fremstilling av pelleten for hydrolyse, og minimerer fuktighetsrester for å forhindre aminosyremodifisering. Imidlertid har 10% vandig TCA pluss sonikering bedre ekstraksjonseffektivitet av frie aminosyrer sammenlignet med 10% TCA i aceton44 alene. I tillegg har 10% vandig TCA-utfelling begrensninger som lang tørketid, ikke å kunne utfelle alle proteiner eller små peptider / biomolekyler, og avhengig av analytten av interesse (dvs. proteiner eller aminosyrer), som krever tilsetningsstoffer og reduksjonsmidler for å forhindre oksidasjon og nedbrytning45,46.
Denne protokollen bruker en kombinasjon av 10% vandig TCA og 10% TCA i aceton for å øke proteinutfelling, sikre at mindre peptider / biomolekyler utfelles, muliggjør raskere pelletstørketider og øker ekstraksjonseffektiviteten, og utnytter begge løsningsmiddelekstraksjonsegenskapene. Kombinasjonen av 10% vandig TCA og 10% TCA i aceton kan imidlertid utfelle små peptider/biomolekyler i fri fraksjon etter at 10% TCA i acetonsupernatant er kombinert med den vandige frie fraksjonen. I dette tilfellet skal bunnfallene overføres til den bundne fraksjonen for hydrolyse.
Den andre halvdelen av denne protokollen innebærer frigjøring av aminosyrer (dvs. BMAA) fra proteinpelleten via syredamphydrolyse ved forhøyede temperaturer i et oksygenfritt miljø. Den overveiende begrensende faktoren for hydrolysetrinnet er at det er tidkrevende og arbeidskrevende å forberede. Inkubasjonen over natten forhindrer rask og tidseffektiv prøvepreparering og analyse. I tillegg er den kvantitative overføringen av pelleten fra et sentrifugerør til et skallhetteglass (trinn 3.4) en vanskelig prosess som krever flid og tålmodighet for å sikre et nøyaktig normaliseringspunkt til tørrvekten. Mulige problemer brukeren kan møte er ufullstendig overføring av pellet, våte utfelte proteiner som fester seg til pipettespisser og det opprinnelige røret, og faste partikler i pelleten som blokkerer pipettespissen. Et praktisk forslag for å hjelpe til med en enklere overføring av pelleten er å fjerne ca. 0,3-0,5 mm av enden av pipettespissen med en saks, slik at større pelletspartikler kan trekkes og slippes ut i hetteglasset. Denne overføringsmetoden er vanlig praksis for proteinekstraksjon for alle aminosyreanalyser. Imidlertid bør modifikasjoner for å forbedre effektiviteten og nøyaktigheten av kvantitativ overføring av pelleten til skallhetteglasset undersøkes.
To former for hydrolyseteknikker kan brukes til å frigjøre aminosyrer fra deres proteinbundne tilstand: væskefasehydrolyse og syredamphydrolyse. Væskefasehydrolyse, som innebærer tilsetning av 6 M HCl på prøven, som deretter plasseres i en 110 ° C ovn over natten, er et alternativ til syredamphydrolysen beskrevet i denne protokollen. Ekstraksjonsteknikker som benytter væskefasehydrolyse kan kreve videre behandling, for eksempel avsalting, spesielt hvis AQC-derivatisering er valgt, da det krever grunnleggende betingelser for merking40. Syredamphydrolyse unngår avsalting og gir brukeren frihet til å velge derivatiseringsteknikk ved rekonstituering av den endelige pelleten før filtrering. Videre, uavhengig av den valgte hydrolysemetoden, kan prøvene kreve videre behandling, for eksempel SPE for matriserensing og konsentrasjon 29,47,48, avhengig av valg av derivatiseringsteknikk og / eller analytisk analyse (f.eks. omvendt fase LC-MS / MS vs. hydrofil interaksjonsvæskekromatografi [HILIC] LC-MS / MS 37 ). Rekonstitueringen av den endelige pelleten i 20 mM HCl i denne protokollen er egnet for derivatisering ved bruk av PCF-reagenser48via et kommersielt tilgjengelig aminosyrehydrolysesett39 (se materialtabell). Både AQC og PCF vil avlede alle aminosyrer, protein og ikke-protein som er tilstede i prøven, og selektiviteten til analyttene oppnås ved bruk av LC-MS / MS og dens kombinasjon av retensjonstidsmatching og nøye utvalg av kvantifikatoren og kvalifiseringen MRM38.
Nåværende hydrolyseprotokoller er ikke optimalisert for frigjøring av BMAA, 2,4-DAB og AEG, men for de 22 proteinaminosyrene basert på eksisterende metoder for proteinhydrolyse 32, hvor inkubasjon i mer enn 18 timer resulterer i nedbrytning og modifisering av visse aminosyrer, som påvirker LC-MS / MS-analyse og dermed de oppnådde konsentrasjonene32. Beach et al.49 undersøkte hydrolyse over tid (0,5-120 timer) for å optimalisere hydrolyse for å analysere BMAA og proteinogene aminosyrer. De fant at selv om det var en tidlig rask frigjøring av BMAA i løpet av de første 0,5 timene av hydrolysen, fortsatte BMAA-nivåene å øke etter hvert som hydrolysetiden økte, uten nedbrytning, selv etter 5 dager49. Det er også fortsatt forskjellige synspunkter og spørsmål om den sanne naturen til bundet BMAA og dens isomerer, med noen studier som tyder på at i stedet for BMAA-binding50,51 eller feilinkorporering i proteiner14, er BMAA-proteinforening overfladisk52. Imidlertid krever den nåværende konsensus i analysen av “bundet” BMAA det validerte og allment aksepterte hydrolysetrinnet som bryter fra hverandre peptider / proteiner for å frigjøre aminosyrer og dermed BMAA og dets isomerer.
Utvinningsgraden av 20 proteinaminosyrer ble bestemt i en studie av Sedgwick et al.42 ved bruk av TCA-ekstraksjon, noe som resulterte i omtrent 100% utvinning. Når det gjelder BMAA og dets isomerer fra algematriser, har studier som sammenligner effektiviteten av BMAA-ekstraksjon ved bruk av forskjellige ekstraksjonsløsningsmidler, funnet at 10% TCA er den mest effektive for gratis BMAA27. Utvinningsgraden for proteinbundet BMAA ekstrahert ved hjelp av væskefasehydrolyse ble etablert i studier av Glover et al.25 og av Faassen et al.53, hvor nøyaktigheten ble bestemt av spiked utvinningsmetoder, med en gjennomsnittlig BMAA-utvinningsgrad på henholdsvis 108,6% og 70%. Faassen og medarbeidere beskrev prosedyrer for spike-recovery eksperimenter og illustrerte hvordan utvinningen varierer avhengig av stadiet i ekstraksjonsprosessen piggen ble gjort53. Faassen og medarbeidere bestemte i tillegg effektiviteten til syredampprotokollen som presenteres her, med utvinningsgrad på 83,6% for BMAA-isomerer pigget før ekstraksjon og 68,6% for de som ble pigget før hydrolyse24. Disse utvinningene, ekstraksjonsmetodene og analysene ble videre validert av Banack 26, med utvinningsgrad på 94% -106% for BMAA i en cyanobakteriell matrise og et% relativt standardavvik (% RSD) mellom 5,6% og20%, og oppfylte FDA-kriteriene for nøyaktighet54. Det anbefales at hvert laboratorium først etablerer sin utvinningsgrad og nøyaktighet før de bruker denne protokollen via spike-gjenopprettingseksperimenter. Restitusjonsmetodene presentert i Faassen et al.53 og Glover et al.25 kan følges som en veiledning.
Alternative former for hydrolyseteknikker kan benyttes i stedet for ovnhydrolyse over natten for raskere proteinbundet ekstraksjon av analytten. For eksempel kan en mikrobølgeekstraktor redusere hydrolysetiden betydelig fra 24 timer til så lite som 10 min55. Mikrobølgehydrolyse for aminosyrer bruker de samme prinsippene som den konvensjonelle termiske metoden, ved hjelp av et hanskerom for å forberede og montere mikrobølgebeholderen i et oksygenfritt miljø og tilsette 6 M HCl. Når den er lufttett, gjennomgår beholderen som inneholder prøven mikrobølgestråling. Mikrobølgehydrolyse har blitt brukt til å trekke ut aminosyrer fra forskjellige prøvematriser56,57,58; Mikrobølgehydrolyse er imidlertid ennå ikke utviklet og validert for analyse av BMAA.
Avslutningsvis er 10% vandig TCA-proteinutfelling den optimale metoden for å trekke ut frie ikke-proteinaminosyrer fra cyanobakterielle matriser27, og termisk hydrolyse gir en pålitelig og reproduserbar ekstraksjon av den proteinbundne fraksjonen. Denne protokollen for å trekke ut NPAA BMAA og dens isomerer fra cyanobakterier er validert og allment akseptert. Fremtidige retninger for ytterligere å optimalisere ekstraksjonen av BMAA vil fokusere på hydrolysetrinnet, som utføres i henhold til spesifikasjonene til de 22 proteinaminosyrene. Imidlertid bør ekstraksjonsprotokollen som presenteres her, fortsatt betraktes som effektiv og effektiv for å analysere BMAA og dens isomerer via LC-MS / MS.
The authors have nothing to disclose.
D.P.B., K.J.R. og S.M.M. støttes av The Ian Potter Foundation, og J.P.V. er mottaker av et australsk regjeringsforskningsprogram, Stipend.
1 mL glass shell vials | SHIMADZU | REST-24663 | |
10% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA | ||
100% TCA solution | Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O) | ||
1000 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z683809 | |
13.3% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA | ||
2 mL tubes | MERCK | BR780546-500EA | |
20 mM HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
20-200 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z740441 | |
6 M HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
70% ethanol | Supelco | 1.11727 | Dilute 70:1 Ethanol:water |
-80 °C Freezer | Martin CHRIST | 102142 | Alpha 2-4 Ldplus |
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit | Waters | 186003836 | |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | 34967-2.5L | |
Analytical Scale Balance | |||
Centrifugal evaporator | Thermo Scientific | 13442549 | DNA120-115 SpeedVac Concentrator |
Centrifuge | MERCK | EP022620100-1EA | |
D5-2,4-DAB standard | CDN Isotopes | D-7568 | |
Drying Oven | |||
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit | Phenomenex | CEO-8492 | |
Falcon tube holder | |||
Falcon Tubes | MERCK | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes |
Filter Tubes | Sigma-Aldrich | CLS8161-100EA | Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm) |
Glass engraver | |||
Hydrolysis vial & Lid | Eldex Laboratories/Waters | WAT007568 & WAT007569 | |
Ice and container | |||
Lint-free paper wipe | Kimwipes/Sigma-Aldrich | Z188956 | |
Milli-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
Nitrogen tap with hose | |||
P1000 Micropipette | MERCK | EP3123000063 | |
P1000 pipette tips | MERCK | Z740127 | |
P200 Micropipette | MERCK | EP3123000055-1EA | |
P200 pipette tips | MERCK | Z740125 | |
Parafilm | MERCK | P7793 | Sealing film |
PPE – noise cancelling headphones | |||
PPE – oven gloves | |||
Probe sonicator | QSONICA Sonicators | Q125 Sonicator | Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones) |
Sample transfer spatula | |||
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399-1KG | |
Tweezers | |||
Vacuum Pump with hose |