टाइप 1 मधुमेह, सीलिएक रोग और कोरोनावायरस रोग 2019 के लिए स्क्रीनिंग की तत्काल आवश्यकता के अनुरूप, हमने एक उच्च थ्रूपुट 6-प्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस परख विकसित की है, जो एक साथ सभी चार आइलेट ऑटोएंटीबॉडी, ऊतक ट्रांसग्लूटामिनेज ऑटोएंटीबॉडीज और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 के रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन के एंटीबॉडी का पता लगाती है।
एक चल रहे नैदानिक परीक्षण, ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर किड्स (एएसके), संयुक्त राज्य अमेरिका में टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) और सीलिएक रोग के लिए सामान्य आबादी में पहला स्क्रीनिंग अध्ययन है। कोरोनावायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी के साथ, आम आबादी में सीओवीआईडी -19 की महामारी विज्ञान और सीओवीआईडी -19 संक्रमण और टी 1 डी विकास के बीच संबंध के बारे में ज्ञान की तत्काल आवश्यकता है। रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) की वर्तमान मानक स्क्रीनिंग विधि ने दो बड़ी चुनौतियों का सामना किया है: एकल परख प्रारूप के साथ कम दक्षता और स्क्रीनिंग में उत्पन्न कम-आत्मीयता एंटीबॉडी के एक बड़े अनुपात के साथ कम रोग विशिष्टता। मल्टीप्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख के मंच के साथ, एक नया 6-प्लेक्स ईसीएल परख विकसित किया गया था, जो एक ही कुएं में, सभी चार आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) को इंसुलिन, ग्लूटामिक एसिड डिकार्बोक्सिलेज (जीएडी 65), इंसुलिनोमा एंटीजन 2 (आईए -2), और जिंक ट्रांसपोर्टर 8 (जेडएनटी 8) को जोड़ता है। covid-19। एएसके अध्ययन से 880 नमूनों का उपयोग करके अंधे में परख को मान्य किया गया था, जिसमें 325 सकारात्मक नमूने और 555 सभी एंटीबॉडी-नकारात्मक नमूने शामिल थे, और मानक आरबीए और एक एकल ईसीएल परख के साथ तुलना की गई थी। उच्च दक्षता, कम लागत और कम सीरम मात्रा के फायदे के साथ, इस परख को एएसके अध्ययन के लिए प्राथमिक स्क्रीनिंग टूल के रूप में स्वीकार किया गया है।
दुनिया भर में बड़े महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चलता है कि टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) की घटनाएं तेजी से 3% -5% सालाना बढ़ रही हैं, और टी 1 डी का प्रसार पिछले 20 वर्षों में दोगुना हो गया है, खासकर छोटे बच्चों में 1,2। आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) आमतौर पर नैदानिक लक्षणों से वर्षों पहले दिखाई देते हैं और वर्तमान में टी 1 डी3 के लिए सबसे विश्वसनीय पूर्वानुमान और नैदानिक बायोमार्कर हैं। टी 1 डी ऑटोएंटीबॉडी के लिए स्क्रीनिंग नैदानिक टी 1 डी में प्रगति के लिए जोखिम वाले लोगों की पहचान कर सकती है, जनता को शिक्षित कर सकती है, बड़े पैमाने पर कीटोएसिडोसिस की जीवन-धमकी देने वाली जटिलता को कम कर सकती है, और रोकथाम उपचारों के लिए नैदानिक परीक्षणों का लाभ उठा सकती है। टी 1 डी के लिए दुनिया भर में रोकथाम के प्रयास चल रहे हैं और नैदानिक टी 1 डी की प्रगति में देरी के लिए आईएबीएस पॉजिटिव वाले विषयों के बीच कई पारंपरिक परीक्षण किए जा रहे हैं, और बारबरा डेविस सेंटर फॉर डायबिटीज ने टी 1 डी और सीलिएक रोग के लिए 2016 में सामान्य आबादी में स्क्रीनिंग का पहला अमेरिकी नैदानिक परीक्षण शुरू किया, ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर द किड्स (एएसके)4 . सीलिएक रोग (सीडी) प्रतिरक्षा और आनुवंशिक कारकों से संबंधित एक पुरानी आंतों की सूजन की बीमारी है। टी 1 डी वाले बच्चों में सीडी की व्यापकता 24.5% तक पहुंच सकती है। सीडी वाले आधे से अधिक व्यक्तियों में प्रस्तुति6 में विशिष्ट लक्षण नहीं हो सकते हैं, इसलिए सीलिएक रोग के लिए सीरोलॉजिकल स्क्रीनिंग काफी आवश्यक है।
कोरोनावायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) की महामारी शुरू होने के बाद से, वैश्विक स्तर पर 200 मिलियन से अधिक मामले सामने आए हैं, और प्रयोगशाला-पुष्टिकिए गए मामलों में से 16% तक बच्चे हैं। कई अध्ययनों ने कोविड-19 संक्रमण की गंभीरता और मृत्यु दर पर मौजूदा टी1डी के प्रभाव को प्रदर्शितकिया है, जबकि टी1डी विकास पर कोविड-19 संक्रमण का प्रभाव स्पष्ट नहीं है। गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) एंटीबॉडी के निर्धारण द्वारा सामान्य आबादी में कोविड-19 संक्रमण की कुल दर की जांच और कोविड-19 संक्रमण और टी 1 डी ऑटोइम्यूनिटी को ट्रिगर करने या टी 1 डी प्रगति में तेजी लाने के बीच संबंध का अध्ययन तत्काल आवश्यक और बहुत महत्वपूर्ण है, जबकि चल रहा एएसके अध्ययन इसके लिए एक उत्कृष्ट मंच है। एकल परख प्रारूप और कम-आत्मीयता एंटीबॉडी सकारात्मकता के एक बड़े अनुपात की पीढ़ी के कारण, मानक रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) ने कम दक्षता और कम रोग विशिष्टता 9 की अड़चन को पूराकिया है। वर्तमान पेपर में, हम एक मल्टीपल-प्लेक्स प्लेट का उपयोग करके हमारे पिछले मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख प्लेटफॉर्म पर निर्मित एक नया 6-प्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख प्रस्तुत करते हैं, जिसमें एक ही कुएं में छह ऑटोएंटीबॉडी परख शामिल हैं, जिसमें इंसुलिन (आईएए), ग्लूटामिक एसिड डीकार्बोक्सिलेज -65 (जीएडीए), इंसुलिनोमा एंटीजन -2 (आईए -2 ए), और जिंक ट्रांसपोर्ट -8 (जेडएनटी 8 ए), ट्रांसग्लूटामिनेज के लिए ऑटोएंटीबॉडी शामिल हैं। और सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) एंटीबॉडी (कोविड-19ए)। यह पहला मल्टीप्लेक्स परख है जिसने चार प्रमुख आईए के एक पूर्ण पैनल की भर्ती की और इसे टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए के साथ जोड़ा। इसे एएसके अध्ययन में मानक आरबीए की जगह प्राथमिक स्क्रीनिंग टूल के रूप में मान्य और औपचारिक रूप से स्वीकार किया गया है।
टी 1 डी के लिए हस्तक्षेप पूर्व-टी 1 डी युग में प्रवेश कर गया है, टी 1 डी के लिए चल रहे राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग कार्यक्रम और नैदानिक टी 1 डी 12,13 की प्रगति को निरस्त करने या धीमा करने के लिए चरण 1 टी 1 डी में तेजी से नैदानिकपरीक्षणों को लागू किया जा रहा है। एकल आईएबी परख प्रारूप के साथ वर्तमान मानक आरबीए का उपयोग करके चार आईएबी का माप बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग कार्यक्रम के लिए श्रमसाध्य और अक्षम है। उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स आईएबीएस परख की तत्काल मांग के साथ, मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख, 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा, और एग्लूटीनेशन-पीसीआर (एडीएपी) द्वारा एंटीबॉडी का पता लगाना वर्तमान में प्रतिस्पर्धी प्रौद्योगिकियों के रूप में उभरा है। जर्मनी में छोटे बच्चों की आबादी में टी 1 डी के लिए स्क्रीनिंग के Fr1da अध्ययन में, 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा संयोजन 3 IAB (GADA, IA-2A, और ZnT8A) को मुख्य परीक्षण14 के रूप में उपयोग किया गया था। 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा की एक बड़ी सीमा आईएए की कमी है, जो ज्यादातर टी 1 डी वाले छोटे बच्चों में उच्च प्रसार के साथ दिखाई देने वाला पहला आईएबी है। इसके अलावा, परख यह भेद करने में सक्षम नहीं है कि तीन आईएबीएस में से कौन सा सकारात्मक संकेत से सकारात्मक है, और प्रत्येक सकारात्मक नमूने को पुष्टि के लिए तीन एकल परखों के साथ दोहराया जाना चाहिए। एडीएपी15 जीएडीए, आईए -2 ए और आईएए को जोड़ता है और आईएएसपी कार्यशाला में उच्च परख संवेदनशीलता और विशिष्टता का चित्रण करता है, लेकिन टी 1 डी अध्ययनों के लिए जनसंख्या-आधारित स्क्रीनिंग में यह कितना पूर्वानुमानित है, जिसके बारे में डेटा का अभाव है, जिसे आईएएसपी कार्यशाला निर्धारित करने में सक्षम नहीं है। वर्तमान अध्ययन में मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख एक एकल ईसीएल परख के मंच पर बनाई गई है जिसे ट्रेलनेट 9,16, डेज़ी 17,18,19 और एएसके 4,20,21 जैसे कई नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान मानक आरबीए के खिलाफ मान्य किया गया है। पढ। एएसके अध्ययन के प्रतिभागियों से 880 सीरम नमूनों का उपयोग करके आरबीए और एकल ईसीएल परख दोनों के खिलाफ वर्तमान परख को मान्य किया गया है। जैसा कि चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है, 6-प्लेक्स और एकल ईसीएल के बीच या 6-प्लेक्स और आरबीए के बीच एंटीबॉडी का स्तर ज्यादातर एंटीबॉडी की सकारात्मकता के लिए एक दूसरे के साथ संगत था। आरबीए और 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस की संयोग दर 91.7% -97.8% थी, और एकल ईसीएल और 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस की संयोग दर 95.3% -99.2% थी। ईसीएल परख और आरबीए के बीच मतभेद मुख्य रूप से एकल आईएबी वाले लोगों से था। 6-प्लेक्स और एकल ईसीएल (आर = 0.6431-0.9434, सभी पी < 0.0001) और 6-प्लेक्स और आरबीए (आर = 0.5775-0.8576, सभी पी < 0.0001) द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस के स्तर भी अच्छी तरह से सहसंबद्ध थे। 6-प्लेक्स परख द्वारा परीक्षण किए गए टीजीए आरबीए (99.4%) और एकल ईसीएल परख (99.4%) दोनों के परिणामों के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध थे। इसके अतिरिक्त, 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए सीओवीआईडी -19 ए एकल ईसीएल परख के परिणामों के साथ 99.8% अनुपालन तक पहुंच गया।
नतीजतन, 6-प्लेक्स ईसीएल परख को औपचारिक रूप से चल रहे एएसके अध्ययन के लिए प्राथमिक स्क्रीनिंग विधि के रूप में स्वीकार किया गया है और मानक आरबीए22 को बदल दिया गया है। इस परख ने मानक आरबीए की तुलना में उच्च थ्रूपुट, कम लागत और सीरम की छोटी मात्रा के साथ अपनी उत्कृष्ट संवेदनशीलता और विशिष्टता का प्रदर्शन किया।
यह प्रलेखित किया गया है कि, टी 1 डी स्क्रीनिंग अध्ययन में, आरबीए द्वारा पता लगाए गए एकल आईएबी, जिसने आईएबी सकारात्मकता का एक बड़ा हिस्सा लिया, कम आत्मीयता के थे, कम बीमारी के जोखिम के साथ, और इसके परिणामस्वरूप समग्र कम पूर्वानुमान मूल्य 19,21,23,24,25,26 था। इस तरह के कम जोखिम की भविष्यवाणी ने अनुवर्ती यात्राओं की भारी अतिरिक्त लागत पैदा की और इसके परिणामस्वरूप टी 1 डी निवारक अध्ययनों के लिए कठिनाइयां हुईं। स्थापित ईसीएल परख मंच को कई नैदानिक परीक्षणों में आरबीए द्वारा उत्पन्न कम-आत्मीयता वाले आईएबी से उच्च-आत्मीयता आईएबी को अलग करने और सभी चार आईएबी के लिए पूर्वानुमानमूल्यों को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाने के लिए प्रदर्शित किया गया है, विशेष रूप से एकल आईएबी सकारात्मकता 16,17,18,21 के साथ। . मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख तकनीक एकल ईसीएल परख के मंच पर बनाई गई थी, जिसमें उच्च-आत्मीयता एबीएस का पता लगाने का यह विशिष्ट लाभ था। वर्तमान अध्ययन में, 6-प्लेक्स ईसीएल परख ने संवेदनशीलता और विशिष्टता में संबंधित एकल ईसीएल परख के साथ अपनी समानता का चित्रण किया।
कई प्लेक्स प्लेटों का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख की कुछ सीमाओं और तकनीकी चिंताओं को पहले से ही पिछले प्रकाशनों27,28 में कवर किया गया है। एक कुएं में छह लेबल एंटीजन के साथ, विभिन्न एंटीजन के बीच कुछ प्रभाव हो सकते हैं, और एक ही कुएं में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी परख जोड़ते समय परख पृष्ठभूमि बढ़ सकती है। परख स्थितियों को समायोजित करने के लिए बड़ी मात्रा में परख अनुकूलन कार्य की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से प्रत्येक एंटीजन के लिए चेकरबोर्ड परख के आधार पर प्रत्येक लेबल एंटीजन प्रोटीन की अंतिम सांद्रता को समायोजित करने के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता बनाए रखने के लिए। जैसा कि पिछलेअध्ययनों 27,28 में उल्लेख किया गया है, नमूनों की एक छोटी संख्या (<1%) के परिणामस्वरूप स्पष्ट अंतर्निहित कारण के बिना कई प्लेक्स प्लेट पर झूठी सकारात्मकता होती है। सभी सकारात्मक परिणामों को नियमित प्रयोगशाला गुणवत्ता आश्वासन के रूप में एकल ईसीएल परख द्वारा दोहराया और पुष्टि की जानी चाहिए; आमतौर पर, झूठी सकारात्मकता को हटा दिया जाएगा। पिछले 7-प्लेक्स ईसीएल परख27,28 में देखे गए “प्रोज़ोन प्रभाव” के कारण गलत-नकारात्मक परिणाम वर्तमान अध्ययन में नहीं देखे गए थे। यहां वर्णित परख में, हमने पिछले प्रोटोकॉल से सीरम नमूनों के एसिड उपचार के चरण को हटा दिया; इसके बजाय, हमने सीरम नमूनों को 30 मिनट (चरण 5.1.) के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट किया। प्लेट धोने के दूसरे दिन, हमने प्लेट को अधिक सख्ती से धोने के लिए नियमित वॉशिंग बफर के बजाय 0.4 एम एनएसीएल (चरण 8.1.) युक्त वॉशिंग बफर का उपयोग किया। इन संशोधनों ने परख संवेदनशीलता को खोए बिना मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख को सरल और कम पृष्ठभूमि बना दिया।
अंत में, इस परख में एक साथ चार आईएबी, टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए का पता लगाने के लिए उत्कृष्ट प्रदर्शन है। मल्टीप्लेक्सिंग फीचर, साथ ही उच्च थ्रूपुट, कम लागत और छोटे सीरम वॉल्यूम की आवश्यकता, टी 1 डी और सहवर्ती बीमारियों के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग को सामान्य आबादी में बहुत अधिक संभव बनाती है। टी 1 डी या किसी भी ऑटोइम्यून बीमारियों वाले रोगियों में अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए बहुत अधिक जोखिम होता है। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख टी 1 डी और कई ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए एक साथ स्क्रीन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन को जेडीआरएफ अनुदान 2-एसआरए-2019-695-एस-बी, 2-एसआरए-2020-965-एस-बी, 1-एसआरए-2017-564-M_N, एनआईएच अनुदान डीके 32083 और मधुमेह अनुसंधान केंद्र (डीआरसी) अनुदान पी 30 डीके 116073 द्वारा समर्थित किया गया था।
5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
Blocker A | MSD | R93AA | |
Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |