Evaluering av fotosyntetisk effektivitet i fotorespiratoriske mutanter ved klorofyllfluorescensanalyse

Summary

Vi beskriver en tilnærming for å måle endringer i fotosyntetisk effektivitet i anlegg etter behandling med lav CO₂ ved bruk av klorofyllfluorescens.

Abstract

Fotosyntese og fotorespirasjon representerer de største karbonfluksene i plantens primære metabolisme og er nødvendige for planteoverlevelse. Mange av enzymer og gener som er viktige for fotosyntese og fotorespirasjon har blitt godt studert i flere tiår, men noen aspekter av disse biokjemiske veiene og deres crosstalk med flere subcellulære prosesser er ennå ikke fullt ut forstått. Mye av arbeidet som har identifisert gener og proteiner som er viktige i plantemetabolisme, har blitt utført under svært kontrollerte miljøer som kanskje ikke best representerer hvordan fotosyntese og fotorespirasjon fungerer under naturlige og oppdrettsmiljøer. Tatt i betraktning at abiotisk stress resulterer i nedsatt fotosyntetisk effektivitet, er det nødvendig med utvikling av en høy gjennomstrømningsskjerm som kan overvåke både abiotisk stress og dens innvirkning på fotosyntese.

Derfor har vi utviklet en relativt rask metode for å screene for abiotiske stressinduserte endringer i fotosyntetisk effektivitet som kan identifisere ukarakteriserte gener med roller i fotorespirasjon ved hjelp av klorofyllfluorescensanalyse og lav CO₂ screening. Dette papiret beskriver en metode for å studere endringer i fotosyntetisk effektivitet i overførte DNA (T-DNA) knockout mutanter i Arabidopsis thaliana. Den samme metoden kan brukes til screening av etylmetansulfonat (EMS)-induserte mutanter eller suppressorscreening. Ved hjelp av denne metoden kan identifisere genkandidater for videre studier i plantens primære metabolisme og abiotiske stressresponser. Data fra denne metoden kan gi innsikt i genfunksjon som kanskje ikke gjenkjennes før eksponering for økte stressmiljøer.

Introduction

Abiotiske stressforhold som ofte ses i bondens felt, kan påvirke avlingene negativt ved å redusere fotosyntetisk effektivitet. Skadelige miljøforhold som varmebølger, klimaendringer, tørke og saltholdighet i jord kan forårsake abiotiske påkjenninger som endrer CO_{2-tilgjengeligheten} og reduserer plantens respons på høyt lysstress. De to største terrestriske karbonfluksene er fotosyntese og fotorespirasjon, som er avgjørende for plantevekst og avlinger. Mange av de viktige proteinene og enzymene som er involvert i disse prosessene har blitt karakterisert under laboratorieforhold og identifisert på genetisk nivå¹. Selv om det er gjort store fremskritt i forståelsen av fotosyntese og fotorespirasjon, forblir mange trinn, inkludert transport mellom planteorganeller, ukarakteriserte ^2,3.

Fotorespirasjon, den nest største karbonfluksen i planter etter fotosyntese, begynner når enzymet Rubisco fikserer oksygen i stedet for karbondioksid til ribulose 1,5 bisfosfat (RuBP), og genererer den hemmende forbindelsen 2-fosfoglykolat (2PG)¹. For å minimere de hemmende effektene av 2PG og for å resirkulere det tidligere faste karbonet, har C3-planter utviklet den multiorganellære prosessen med fotorespirasjon. Fotorespirasjon konverterer to molekyler av 2PG til ett molekyl av 3-fosfoglyserat (3PGA), som kan komme inn i C3-karbonfikseringssyklusen¹. Dermed konverterer fotorespirasjon bare 75% av det tidligere faste karbonet fra genereringen av 2PG og forbruker ATP i prosessen. Som et resultat er prosessen med fotorespirasjon et betydelig 10% -50% drag på fotosyntetisk prosess, avhengig av vanntilgjengelighet og vekstsesongtemperaturer⁴.

Enzymene som er involvert i fotorespirasjon har vært et forskningsområde i flere tiår, men bare et lite antall transportproteiner har blitt karakterisert på genetisk nivå, selv om minst 25 transporttrinn er involvert i prosessen ^5,6,7. De to transportproteinene som er direkte involvert i bevegelsen av karbon generert i fotorespirasjonsprosessen er plastidisk glykolat / glyserattransportør PLGG1 og gallesyrenatriumsymporter BASS6, som begge er involvert i eksport av glykolat fra kloroplast ^5,6.

Under ambient [CO₂] fikserer Rubisco et oksygenmolekyl til RuBP omtrent 20% av tiden¹. Når planter blir utsatt for lav [CO 2], øker fotorespirasjonshastigheten, noe som gjør lav [CO₂] til et ideelt miljø for å teste for mutanter som kan være viktige under forhøyet fotorespirasjonsstress. Testing av ytterligere antatt kloroplasttransportprotein T-DNA-linjer under lav CO₂ i 24 timer og måling av endringer i klorofyllfluorescens førte til identifisering av bass6-1 plantelinjer som viste en fotorespirasjonsmutant fenotype⁵. Videre karakterisering viste at BASS6 er en glykolattransportør i kloroplastens indre membran.

Dette papiret beskriver i detalj en protokoll som ligner på det som opprinnelig ble brukt til å identifisere BASS6 som en fotorespirasjonstransportør, som kom fra en liste over antatte transportproteiner lokalisert i kloroplastmembranen⁸ Denne protokollen kan brukes i et høykapasitetseksperiment som karakteriserer Arabidopsis T-DNA-mutanter eller EMS-genererte mutantplanter som en måte å identifisere gener som er viktige for å opprettholde fotosyntetisk effektivitet under en rekke abiotiske spenninger som varme, høyt lysstress, tørke og CO_{2-tilgjengelighet} . Screening av plantemutanter ved hjelp av klorofyllfluorescens har tidligere blitt brukt til raskt å identifisere gener som er viktige for primær metabolisme⁹. Med så mye som 30% av Arabidopsis-genomet som inneholder gener som koder for proteiner med ukjent eller dårlig karakterisert funksjon, kan stressindusert analyse av fotosyntetisk effektivitet gi innsikt i molekylære funksjoner som ikke observeres under kontrollerte forhold i mutante planter¹⁰. Målet med denne metoden er å identifisere mutanter av fotorespiratorisk vei ved hjelp av en lav CO_{2 screening} . Vi presenterer en metode for å identifisere mutanter som forstyrrer fotorespirasjon etter eksponering for lav CO₂. En fordel med denne metoden er at det er en høy gjennomstrømningsscreening for frøplanter som kan gjøres på relativt kort tid. Videoprotokollseksjonene gir detaljer om frøforberedelse og sterilisering, plantevekst og lav CO_2-behandling , konfigurasjonen av fluorescensavbildningssystemet, måling av kvanteutbytte av de behandlede prøvene, representative resultater og konklusjoner.

Protocol

1. Frøforberedelse og sterilisering MERK: Frøforberedelse består av frø imbibing og frø sterilisering. Det er viktig å merke seg at alle disse trinnene skal utføres i en laminær strømningshette for å opprettholde sterile forhold. Alle nødvendige materialer, reagenser og vekstmedier må autoklaveres (se materialtabellen). Seed imbibation og stratifiseringMERK: Frølinjene som brukes er plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (sa…

Representative Results

Resultatene viser platebilder av rå- og fluorescensbilder fra omgivelses- og lav CO2-screening av WT og testmutanter. Hver plantlet er merket med områdenummer, med tilsvarende fluorescensavlesninger gitt som QY. Dataene eksporteres som en tekstfil og kan åpnes i et regneark for analyse (se tilleggstabell S1). Mutantlinjene plgg1-1 og abcb26 ble valgt for å demonstrere positiv og negativ identifisering av gener assosiert med fotorespiratorisk stress. PLGG1 koder for den f?…

Discussion

De eksperimentelle metodene som er skissert i denne artikkelen, har noen fordeler og begrensninger. En fordel er at denne metoden kan skjerme mange planteplanter, selv om det må tas noen forholdsregler for å forhindre forurensning av plantemedieplaten under pletterings- og vekstprosessen. Derfor er det viktig å forsegle Arabidopsis-platene med kirurgisk tape. En annen fordel med dette eksperimentet er at det har en kortere 12 timers fotorespiratorisk stressperiode sammenlignet med det tidligere publiserte arbeidet<sup…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization