Fotorespiratuar Mutantlarda Fotosentetik Etkinliğin Klorofil Floresan Analizi ile Değerlendirilmesi
Summary
Klorofil floresansı kullanılarak düşük CO2 ile muamele edildikten sonra bitkilerde fotosentetik verimlilikteki değişiklikleri ölçmek için bir yaklaşım tanımladık.
Abstract
Fotosentez ve fotorespirasyon, bitki primer metabolizmasındaki en büyük karbon akışlarını temsil eder ve bitki hayatta kalması için gereklidir. Fotosentez ve fotorespirasyon için önemli olan enzimlerin ve genlerin birçoğu on yıllardır iyi çalışılmıştır, ancak bu biyokimyasal yolakların bazı yönleri ve bunların birkaç hücre altı süreçle olan etkileşimleri henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bitki metabolizmasında önemli olan genleri ve proteinleri tanımlayan çalışmaların çoğu, fotosentez ve fotorespirasyonun doğal ve tarım ortamlarında nasıl çalıştığını en iyi şekilde temsil etmeyebilecek oldukça kontrollü ortamlar altında gerçekleştirilmiştir. Abiyotik stresin fotosentetik verimliliğin bozulmasına neden olduğu göz önüne alındığında, hem abiyotik stresi hem de fotosentez üzerindeki etkisini izleyebilen yüksek verimli bir ekranın geliştirilmesi gereklidir.
Bu nedenle, klorofil floresan analizi ve düşük CO2 taraması kullanarak fotorespirasyonda rolleri olan karakterize edilmemiş genleri tanımlayabilen fotosentetik verimlilikte abiyotik strese bağlı değişiklikleri taramak için nispeten hızlı bir yöntem geliştirdik. Bu yazıda, Arabidopsis thaliana’da transfer edilen DNA (T-DNA) nakavt mutantlarında fotosentetik verimlilikteki değişiklikleri incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Aynı yöntem, etil metansülfonat (EMS) kaynaklı mutantların taranması veya baskılayıcı taramanın yapılması için de kullanılabilir. Bu yöntemin kullanılması, bitki primer metabolizması ve abiyotik stres yanıtlarında daha fazla çalışma için gen adaylarını belirleyebilir. Bu yöntemden elde edilen veriler, artan stres ortamlarına maruz kalana kadar tanınmayabilecek gen fonksiyonu hakkında fikir verebilir.
Introduction
Çiftçi tarlalarında yaygın olarak görülen abiyotik stres koşulları, fotosentetik verimliliği azaltarak mahsul verimini olumsuz yönde etkileyebilir. Isı dalgaları, iklim değişikliği, kuraklık ve toprak tuzluluğu gibi zararlı çevresel koşullar, CO2 kullanılabilirliğini değiştiren ve bir bitkinin yüksek ışık stresine tepkisini azaltan abiyotik streslere neden olabilir. En büyük iki karasal karbon akışı, bitki büyümesi ve mahsul verimi için gerekli olan fotosentez ve fotoresolunumdur. Bu süreçlerde yer alan önemli proteinlerin ve enzimlerin birçoğu laboratuvar koşullarında karakterize edilmiş ve genetik seviye1’de tanımlanmıştır. Fotosentez ve fotorespirasyonun anlaşılmasında çok ilerleme kaydedilmesine rağmen, bitki organelleri arasındaki taşıma da dahil olmak üzere birçok adım karakterize edilmemiştir 2,3.
Fotosentezden sonra bitkilerdeki en büyük ikinci karbon akışı olan fotorespirasyon, Rubisco enziminin karbondioksit yerine oksijeni ribuloz 1,5 bisfosfata (RuBP) sabitleyerek inhibitör bileşik 2-fosfoglikolat (2PG) 1’i üretmesiyle başlar. 2PG’nin inhibitör etkilerini en aza indirmek ve daha önce sabitlenmiş karbonu geri dönüştürmek için, C3 bitkileri çok organellar fotorespirasyon sürecini geliştirmiştir. Fotorespirasyon, 2PG’nin iki molekülünü, C3 karbon fiksasyon döngüsü1’e tekrar girebilen bir 3-fosfogliserat (3PGA) molekülüne dönüştürür. Böylece, fotorespirasyon, daha önce sabitlenmiş karbonun sadece% 75’ini 2PG üretiminden dönüştürür ve süreçte ATP tüketir. Sonuç olarak, fotorespirasyon işlemi, su mevcudiyetine ve büyüme mevsimi sıcaklıklarına bağlı olarak, fotosentetik işlem üzerinde% 10 -% 50’lik önemli bir sürüklenmedir4.
Fotorespirasyonda yer alan enzimler on yıllardır araştırma odağı olmuştur, ancak en az 25 taşıma adımısürece dahil olmasına rağmen, genetik düzeyde sadece az sayıda taşıma proteini karakterize edilmiştir 5,6,7. Fotorespirasyon sürecinde üretilen karbonun hareketine doğrudan dahil olan iki taşıma proteini, her ikisi de kloroplast 5,6’dan glikolat ihracatında rol oynayan plastidik glikolat / gliserat taşıyıcı PLGG1 ve safra asidi sodyum simporter BASS6’dır.
Ortam [CO2] altında, Rubisco bir oksijen molekülünü RuBP’ye zamanın yaklaşık% 20’sinde sabitler1. Bitkiler düşük [CO 2] ‘ye maruz kaldığında, fotorespirasyon oranları artar, bu da düşük [CO2] ‘yi, yüksek fotorespirasyon stresi altında önemli olabilecek mutantları test etmek için ideal bir ortam haline getirir. 24 saat boyunca düşük CO2 altında ek varsayılan kloroplast taşıma proteini T-DNA hatlarının test edilmesi ve klorofil floresansındaki değişikliklerin ölçülmesi, fotorespirasyon mutant fenotip5’i gösteren bass6-1 bitki hatlarının tanımlanmasına yol açmıştır. Daha ileri karakterizasyon, BASS6’nın kloroplastın iç zarında bir glikolat taşıyıcı olduğunu göstermiştir.
Bu makale, başlangıçta BASS6’yı kloroplast zarı içinde bulunan varsayılan taşıma proteinlerinin bir listesinden gelen bir fotorespirasyon taşıyıcısı olarak tanımlamak için kullanılana benzer bir protokolü ayrıntılı olarak açıklamaktadır8 Bu protokol, Arabidopsis T-DNA mutantlarını veya EMS tarafından üretilen mutant bitkileri, ısı gibi bir dizi abiyotik stres altında fotosentetik verimliliği korumak için önemli olan genleri tanımlamanın bir yolu olarak karakterize eden yüksek verimli bir deneyde kullanılabilir. yüksek ışık stresi, kuraklık ve CO2 kullanılabilirliği. Klorofil floresansı kullanarak bitki mutantlarının taranması, geçmişte primer metabolizma için önemli olan genleri hızlı bir şekilde tanımlamak için kullanılmıştır9. Arabidopsis genomunun% 30’u bilinmeyen veya zayıf karakterize edilmiş fonksiyona sahip proteinleri kodlayan genleri içerdiğinden, fotosentetik verimliliğin strese bağlı analizi, mutant bitkilerde kontrollü koşullar altında gözlenmeyen moleküler fonksiyonlar hakkında fikir verebilir10. Bu yöntemin amacı, düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar yolun mutantlarını tanımlamaktır. Düşük CO2’ye maruz kaldıktan sonra fotorespirasyonu bozan mutantları tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin bir avantajı, nispeten kısa sürede yapılabilecek fideler için yüksek verimli bir tarama olmasıdır. Video protokolü bölümleri, tohum hazırlama ve sterilizasyonu, bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtma, floresan görüntüleme sisteminin konfigürasyonu, işlenmiş numunelerin kuantum veriminin ölçülmesi, temsili sonuçlar ve sonuçlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede özetlenen deneysel yöntemler bazı avantajlar ve sınırlamalarla birlikte gelir. Bir avantaj, bu yöntemin birçok bitki fidesini tarayabilmesidir, ancak kaplama ve yetiştirme işlemi sırasında bitki ortam plakasının kirlenmesini önlemek için bazı önlemler alınmalıdır. Bu nedenle, Arabidopsis plakalarını cerrahi bantla kapatmak çok önemlidir. Bu deneyin bir diğer avantajı, daha önceyayınlanan 8 çalışmasına kıyasla 12 saatlik daha kısa bir fotorespiratuar st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Louisiana Regents Kurulu (AWD-AM210544) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
Referências
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
