Analyse af astrocytterritoriumvolumen og flisebelægning i tykke fritflydende vævssektioner
Summary
Denne protokol beskriver metoder til sektionering, farvning og billeddannelse af fritsvævende vævssektioner i musehjernen efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af analysen af astrocytområdevolumen og astrocytterritoriumoverlapning eller flisebelægning.
Abstract
Astrocytter besidder en forbløffende grad af morfologisk kompleksitet, der gør det muligt for dem at interagere med næsten alle typer celler og strukturer i hjernen. Gennem disse interaktioner regulerer astrocytter aktivt mange kritiske hjernefunktioner, herunder synapsedannelse, neurotransmission og ionhomeostase. I gnaverhjernen vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet i løbet af de første tre postnatale uger og etablerer forskellige, ikke-overlappende territorier for at flise hjernen. Denne protokol giver en etableret metode til analyse af astrocytområdevolumen og astrocytfliser ved hjælp af fritsvævende vævssektioner fra musehjernen. For det første beskriver denne protokol trinene til vævsindsamling, kryosesektion og immunostaining af fritflydende vævssektioner. For det andet beskriver denne protokol billedoptagelse og analyse af astrocytområdevolumen og territoriumoverlapningsvolumen ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware. Endelig diskuterer dette manuskript fordelene, vigtige overvejelser, almindelige faldgruber og begrænsninger ved disse metoder. Denne protokol kræver hjernevæv med sparsom eller mosaik fluorescerende mærkning af astrocytter og er designet til at blive brugt med fælles laboratorieudstyr, konfokal mikroskopi og kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware.
Introduction
Astrocytter er udførligt forgrenede celler, der udfører mange vigtige funktioner i hjernen1. I musebarken giver radiale glialstamceller anledning til astrocytter i de sene embryonale og tidlige postnatale stadier2. I løbet af de første tre postnatale uger vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet og udvikler tusindvis af fine grene, der direkte interagerer med synapser1. Samtidig interagerer astrocytter med tilstødende astrocytter for at etablere diskrete, ikke-overlappende territorier for at flise hjernen3, samtidig med at kommunikationen opretholdes via gap junction kanaler4. Astrocytmorfologi og organisation forstyrres i mange sygdomstilstande efter fornærmelse eller skade5, hvilket indikerer betydningen af disse processer for korrekt hjernefunktion. Analyse af astrocytmorfologiske egenskaber under normal udvikling, aldring og sygdom kan give værdifuld indsigt i astrocytbiologi og fysiologi. Desuden er analyse af astrocytmorfologi efter genetisk manipulation et værdifuldt værktøj til at skelne mellem de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer etablering og vedligeholdelse af astrocytmorfologisk kompleksitet.
Analyse af astrocytmorfologi i musehjernen kompliceres af både astrocytforgreningskompleksitet og astrocytfliser. Antistoffarvning ved hjælp af det mellemliggende filament glial fibrillary acidic protein (GFAP) som en astrocytspecifik markør fanger kun de vigtigste grene og undervurderer i høj grad astrocytmorfologisk kompleksitet1. Andre cellespecifikke markører såsom glutamattransportør 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminsyntetase eller S100β gør et bedre stykke arbejde med at mærke astrocytgrene6, men introducerer et nyt problem. Astrocytområder er stort set ikke overlappende, men der findes en lille grad af overlapning ved de perifere kanter. På grund af kompleksiteten af forgrening, når nærliggende astrocytter er mærket med samme farve, er det umuligt at skelne, hvor den ene astrocyt slutter, og den anden begynder. Sparsom eller mosaikmærkning af astrocytter med endogene fluorescerende proteiner løser begge problemer: den fluorescerende markør fylder cellen for at fange alle grene og giver mulighed for billeddannelse af individuelle astrocytter, der kan skelnes fra deres naboer. Flere forskellige strategier er blevet brugt til at opnå sparsom fluorescerende mærkning af astrocytter, med eller uden genetisk manipulation, herunder viral injektion, plasmidelektroporation eller transgene muselinjer. Detaljer om gennemførelsen af disse strategier er beskrevet i tidligere offentliggjorte undersøgelser og protokoller 1,7,8,9,10,11,12,13.
Denne artikel beskriver en metode til måling af astrocytområdevolumen fra musehjerner med fluorescerende mærkning i en sparsom population af astrocytter (figur 1). Fordi den gennemsnitlige diameter af en astrocyt i musebarken er ca. 60 μm, bruges 100 μm tykke sektioner til at forbedre effektiviteten ved at fange individuelle astrocytter i deres helhed. Immunostaining er ikke påkrævet, men anbefales at forbedre det endogene fluorescerende signal til konfokal billeddannelse og analyse. Immunostaining kan også muliggøre bedre påvisning af fine astrocytgrene og reducere fotobleaching af endogene proteiner under billedoptagelse. For at forbedre antistofindtrængningen i de tykke sektioner og for at bevare vævsvolumen fra sektionering gennem billeddannelse anvendes fritsvævende vævssektioner. Analyse af astrocytområdevolumen udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware. Derudover beskriver denne protokol en metode til analyse af astrocytfliser i vævssektioner med mosaikmærkning, hvor naboaristotter udtrykker forskellige fluorescerende etiketter. Denne protokol er blevet brugt med succes i flere nylige undersøgelser 1,8,9 til at karakterisere astrocytvækst under normal hjerneudvikling samt virkningen af genetisk manipulation på astrocytudvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en etableret metode til analyse af astrocytområdevolumen og astrocytfliser i musebarken, der beskriver alle de vigtigste trin, der begynder med perfusion og slutter med billedanalyse. Denne protokol kræver hjerner fra mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i en sparsom eller mosaikpopulation af astrocytter. Uden for dette krav kan mus i alle aldre anvendes til denne protokol med kun mindre justeringer af perfusionsindstillinger og mængden af frysemedier tilføjet til indlejringsformen. Me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mikroskopi blev udført på UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), delvist støttet af finansiering fra NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Billederne og dataene i figur 4 er genoptrykt fra en tidligere publikation9 med tilladelse fra udgiveren.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
Referências
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
