Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.
Abstract
Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.
Introduction
Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen1. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien2. Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren1. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln3, während die Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle4 aufrechterhalten wird. Astrozytenmorphologie und -organisation sind in vielen Krankheitszuständen nach Beleidigung oder Verletzunggestört 5, was auf die Bedeutung dieser Prozesse für die ordnungsgemäße Gehirnfunktion hinweist. Die Analyse der morphologischen Eigenschaften von Astrozyten während normaler Entwicklung, Alterung und Krankheit kann wertvolle Einblicke in die Biologie und Physiologie der Astrozyten liefern. Darüber hinaus ist die Analyse der Astrozytenmorphologie nach genetischer Manipulation ein wertvolles Werkzeug, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu erkennen, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der morphologischen Komplexität der Astrozyten steuern.
Die Analyse der Astrozytenmorphologie im Gehirn der Maus wird sowohl durch die Komplexität der Astrozytenverzweigung als auch durch die Astrozytenkachelung erschwert. Die Antikörperfärbung unter Verwendung des intermediären Filament-Glia-Fibrillensäureproteins (GFAP) als astrozytenspezifischer Marker erfasst nur die Hauptzweige und unterschätzt die morphologische Komplexität der Astrozytenerheblich 1. Andere zellspezifische Marker wie Glutamattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), Glutaminsynthetase oder S100β ermöglichen eine bessere Markierung von Astrozytenzweigen6, führen jedoch zu einem neuen Problem. Astrozyten-Territorien sind weitgehend nicht überlappend, aber ein kleiner Grad an Überlappung existiert an den peripheren Kanten. Aufgrund der Komplexität der Verzweigung, wenn benachbarte Astrozyten mit der gleichen Farbe beschriftet werden, ist es unmöglich zu unterscheiden, wo ein Astrozyt endet und der andere beginnt. Die spärliche oder mosaikartige Markierung von Astrozyten mit endogenen fluoreszierenden Proteinen löst beide Probleme: Der fluoreszierende Marker füllt die Zelle, um alle Zweige zu erfassen, und ermöglicht die Abbildung einzelner Astrozyten, die von ihren Nachbarn unterschieden werden können. Verschiedene Strategien wurden verwendet, um eine spärliche fluoreszierende Markierung von Astrozyten mit oder ohne genetische Manipulation zu erreichen, einschließlich viraler Injektion, Plasmidelektroporation oder transgener Mauslinien. Details zur Umsetzung dieser Strategien sind in bereits veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des Astrozytengebietsvolumens von Mäusegehirnen mit fluoreszierender Markierung in einer spärlichen Population von Astrozyten (Abbildung 1). Da der durchschnittliche Durchmesser eines Astrozyten im Mauskortex etwa 60 μm beträgt, werden 100 μm dicke Abschnitte verwendet, um die Effizienz bei der Erfassung einzelner Astrozyten in ihrer Gesamtheit zu verbessern. Eine Immunfärbung ist nicht erforderlich, wird jedoch empfohlen, um das endogene Fluoreszenzsignal für die konfokale Bildgebung und Analyse zu verstärken. Die Immunfärbung kann auch einen besseren Nachweis von feinen Astrozytenzweigen ermöglichen und die Photobleiche von endogenen Proteinen während der Bildaufnahme reduzieren. Um das Eindringen von Antikörpern in die dicken Abschnitte zu verbessern und das Gewebevolumen vom Schneiden durch Bildgebung zu erhalten, werden frei schwebende Gewebeabschnitte verwendet. Die Analyse des Astrozytengebietsvolumens wird mit handelsüblicher Bildanalysesoftware durchgeführt. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Analyse von Astrozytenkacheln in Gewebeabschnitten mit Mosaikmarkierung, bei der benachbarte Astrozyten unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen exprimieren. Dieses Protokoll wurde in mehreren neueren Studien 1,8,9 erfolgreich verwendet, um das Astrozytenwachstum während der normalen Gehirnentwicklung sowie die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die Astrozytenentwicklung zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Mikroskopie wurde am UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) durchgeführt, teilweise unterstützt durch Mittel aus dem NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und dem NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Die Bilder und Daten in Abbildung 4 werden mit Genehmigung des Herausgebers aus einer früheren Publikation 9 nachgedruckt.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
Referências
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