Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme
Summary
Bu protokol, fare beyninin serbest yüzen doku bölümlerini bölümleme, boyama ve görüntüleme yöntemlerini açıklar, ardından astrosit bölgesi hacminin ve astrosit bölgesi örtüşmesinin veya döşemesinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması gelir.
Abstract
Astrositler, beyindeki hemen hemen her tür hücre ve yapı ile etkileşime girmelerini sağlayan şaşırtıcı derecede morfolojik karmaşıklığa sahiptir. Bu etkileşimler sayesinde, astrositler sinaps oluşumu, nörotransmisyon ve iyon homeostazı dahil olmak üzere birçok kritik beyin fonksiyonunu aktif olarak düzenler. Kemirgen beyninde, astrositler doğum sonrası ilk üç hafta boyunca boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve beyni döşemek için farklı, örtüşmeyen bölgeler oluşturur. Bu protokol, fare beyninden serbest yüzen doku kesitleri kullanarak astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için yerleşik bir yöntem sağlar. İlk olarak, bu protokol serbest yüzen doku kesitlerinin doku toplanması, kriyoseksiyonu ve immün boyama adımlarını açıklar. İkincisi, bu protokol, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımını kullanarak astrosit bölgesi hacminin ve bölge örtüşme hacminin görüntü alımını ve analizini açıklar. Son olarak, bu makale bu yöntemlerin avantajlarını, önemli hususlarını, ortak tuzaklarını ve sınırlamalarını tartışmaktadır. Bu protokol, astrositlerin seyrek veya mozaik floresan etiketlemeli beyin dokusunu gerektirir ve ortak laboratuvar ekipmanı, konfokal mikroskopi ve ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
Introduction
Astrositler, beyinde birçok önemli işlevi yerine getiren özenle dallanmış hücrelerdir1. Fare korteksinde, radyal glial kök hücreler, geç embriyonik ve erken doğum sonrası aşamalarda astrositlere yol açar2. Doğum sonrası ilk üç hafta boyunca, astrositler boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve sinapslarla doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal geliştirir1. Aynı zamanda, astrositler komşu astrositlerle etkileşime girerek beynidöşemek için ayrık, örtüşmeyen bölgeler oluşturur 3, aynı zamanda boşluk kavşak kanalları4 aracılığıyla iletişimi sürdürür. Astrosit morfolojisi ve organizasyonu, hakaret veya yaralanma5’i takiben birçok hastalık durumunda bozulur ve bu süreçlerin uygun beyin fonksiyonu için önemini gösterir. Normal gelişim, yaşlanma ve hastalık sırasında astrosit morfolojik özelliklerinin analizi, astrosit biyolojisi ve fizyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, genetik manipülasyonu takiben astrosit morfolojisinin analizi, astrosit morfolojik karmaşıklığının kurulmasını ve sürdürülmesini yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları ayırt etmek için değerli bir araçtır.
Fare beynindeki astrosit morfolojisinin analizi, hem astrosit dallanma karmaşıklığı hem de astrosit döşemesi ile karmaşıktır. Astrosit-spesifik bir belirteç olarak ara filament glial fibriler asidik proteini (GFAP) kullanan antikor boyaması, sadece ana dalları yakalar ve astrosit morfolojik karmaşıklığını büyük ölçüde hafife alır1. Glutamat taşıyıcı 1 (GLT-1; slc1a2), glutamin sentetaz veya S100β gibi diğer hücreye özgü belirteçler, astrosit dalları6’yı etiketlemek için daha iyi bir iş çıkarır, ancak yeni bir sorun ortaya çıkarır. Astrosit bölgeleri büyük ölçüde örtüşmez, ancak periferik kenarlarda küçük bir örtüşme derecesi vardır. Dallanmanın karmaşıklığı nedeniyle, komşu astrositler aynı renkte etiketlendiğinde, bir astrositin nerede bittiğini ve diğerinin nerede başladığını ayırt etmek imkansızdır. Astrositlerin endojen floresan proteinlerle seyrek veya mozaik etiketlenmesi her iki sorunu da çözer: floresan işaretleyici, tüm dalları yakalamak için hücreyi doldurur ve komşularından ayırt edilebilen bireysel astrositlerin görüntülenmesine izin verir. Viral enjeksiyon, plazmid elektroporasyonu veya transgenik fare çizgileri dahil olmak üzere genetik manipülasyon olsun veya olmasın, astrositlerin seyrek floresan etiketlemesini sağlamak için birkaç farklı strateji kullanılmıştır. Bu stratejilerin uygulanmasına ilişkin ayrıntılar daha önce yayınlanmış çalışmalarda veprotokoller 1,7,8,9,10,11,12,13’te açıklanmıştır.
Bu makalede, seyrek bir astrosit popülasyonunda floresan etiketleme ile fare beyinlerinden astrosit bölgesi hacmini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Fare korteksindeki bir astrositin ortalama çapı yaklaşık 60 μm olduğundan, bireysel astrositleri bütünüyle yakalamadaki verimliliği artırmak için 100 μm kalınlığında bölümler kullanılır. İmmünoboyama gerekli değildir, ancak konfokal görüntüleme ve analiz için endojen floresan sinyalini arttırmak için önerilir. İmmün boyama ayrıca ince astrosit dallarının daha iyi tespit edilmesini sağlayabilir ve görüntü elde etme sırasında endojen proteinlerin fotobeyazlatmasını azaltabilir. Kalın kesitlere antikor penetrasyonunu arttırmak ve doku hacmini görüntüleme yoluyla kesitlemeden korumak için serbest yüzen doku kesitleri kullanılır. Astrosit bölgesi hacminin analizi, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, bu protokol, komşu astrositlerin farklı floresan etiketlerini ifade ettiği mozaik etiketli doku kesitlerinde astrosit döşemesinin analizi için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, normal beyin gelişimi sırasında astrosit büyümesini ve genetik manipülasyonun astrosit gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmek için 1,8,9 numaralı son çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, fare korteksindeki astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için kurulmuş bir yöntemi açıklar ve perfüzyonla başlayan ve görüntü analizi ile biten tüm önemli adımları detaylandırır. Bu protokol, seyrek veya mozaik bir astrosit popülasyonunda floresan proteinleri eksprese eden farelerden beyinler gerektirir. Bu gereksinimin dışında, bu protokol için her yaştan fare kullanılabilir, perfüzyon ayarlarında sadece küçük ayarlamalar yapılır ve gömme kalıbına e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mikroskopi, kısmen NIH-NINDS Sinirbilim Merkezi Destek Hibe P30 NS045892 ve NIH-NICHD Zihinsel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Hibe U54 HD079124’ün finansmanıyla desteklenen UNC Sinirbilim Mikroskopi Çekirdeğinde (RRID: SCR_019060) gerçekleştirildi. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur. Şekil 4’teki görüntüler ve veriler, yayımcının izniyle önceki bir yayın9’dan yeniden yazdırılmıştır.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
Referências
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
