एकाधिक फ्लोरोसेंट धुंधला और ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण का उपयोग करके 3 डी पैटर्न में बालों वाली और चमकदार त्वचा का प्रदर्शन
Summary
ऊतक वर्गों की मोटाई ने त्वचा के रूपात्मक अध्ययन को सीमित कर दिया। वर्तमान प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत मोटी 300 μm ऊतक वर्गों में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की कल्पना करने के लिए एक अद्वितीय ऊतक समाशोधन तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
त्वचा की वृद्धि परिधीय तंत्रिका तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। यद्यपि त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का अध्ययन तेजी से आगे बढ़ा है, लेकिन उनके वितरण और रासायनिक विशेषताओं की अधिकांश समझ पतले ऊतक वर्गों पर पारंपरिक हिस्टोकेमिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने से आती है। ऊतक समाशोधन तकनीक के विकास के साथ, मोटे ऊतक वर्गों पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को देखना संभव हो गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा से 300 μm की मोटाई पर ऊतक वर्गों पर कई फ्लोरोसेंट धुंधला का वर्णन करता है, दो विशिष्ट बालों वाली और चमकदार त्वचा साइटें। यहां, कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड संवेदी तंत्रिका तंतुओं को लेबल करता है, जबकि फालोइडिन और लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनन रिसेप्टर 1 क्रमशः रक्त और लसीका वाहिकाओं को लेबल करते हैं। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत, लेबल संवेदी तंत्रिका तंतुओं को पूरी तरह से लंबी दूरी पर पीछा किया गया था, गहरी त्वचीय परत में बंडलों में चल रहा था और सतही परत में फ्रीस्टाइल था। ये तंत्रिका तंतु रक्त वाहिकाओं के समानांतर या घिरे हुए थे, और लसीका वाहिकाओं ने बालों वाली और चमकदार त्वचा में एक त्रि-आयामी (3 डी) नेटवर्क का गठन किया। वर्तमान प्रोटोकॉल पद्धति परिप्रेक्ष्य से मौजूदा पारंपरिक तरीकों की तुलना में त्वचा का अध्ययन करने के लिए एक अधिक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Introduction
त्वचा, शरीर का सबसे बड़ा अंग, पर्यावरण के लिए एक महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस के रूप में सेवा करता है, कई तंत्रिका तंतुओं 1,2,3 द्वारा घनीभूत रूप से आंतरिक होता है। यद्यपि त्वचा के अंतर्वेशन का व्यापक रूप से विभिन्न हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ पहले अध्ययन किया गया है, जैसे कि पूरे माउंट त्वचा और ऊतक अनुभाग 4,5,6 पर धुंधला होना, त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का विस्तृत प्रभावी प्रदर्शन अभी भी एक चुनौती 7,8 है। यह देखते हुए, वर्तमान प्रोटोकॉल ने मोटी ऊतक अनुभाग में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को अधिक स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करने के लिए एक अनूठी तकनीक विकसित की।
वर्गों की मोटाई की सीमा के कारण, अंतर्निहित त्वचा तंत्रिका तंतुओं का अवलोकन कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) तंत्रिका तंतुओं और अधिग्रहित छवि जानकारी से स्थानीय ऊतकों और अंगों के बीच संबंधों को सटीक रूप से चित्रित करने के लिए पर्याप्त सटीक नहीं है। 3 डी ऊतक समाशोधन प्रौद्योगिकी का उद्भव इस समस्या को हल करने के लिए एक व्यवहार्य विधि प्रदान करताहै 9,10। ऊतक-समाशोधन दृष्टिकोण के तेजी से विकास ने हाल के दिनों में ऊतक संरचनाओं, पूरे अंगों, न्यूरोनल अनुमानों और पूरे जानवरों का अध्ययन करने के लिए कई उपकरण ोंकी पेशकश की है 11. पारदर्शी त्वचा ऊतक को त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की कल्पना करने के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बहुत मोटे खंड में चित्रित किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, एक चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा को बालों वाली और चमकदार त्वचा 3,4,7 के दो लक्ष्य स्थलों के रूप में चुना गया था। लंबी दूरी पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का पता लगाने के लिए, त्वचा के ऊतकों को इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोकेमिकल धुंधला होने के लिए 300 μm की मोटाई पर काटा गया था, इसके बाद ऊतक समाशोधन उपचार किया गया था। सीजीआरपी का उपयोग संवेदी तंत्रिका तंतुओं12,13 को लेबल करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, ऊतक पृष्ठभूमि पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को उजागर करने के लिए, फालोइडिन और लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनन रिसेप्टर 1 (एलवाईवीई 1) का उपयोग क्रमशः14,15 रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया था।
इन दृष्टिकोणों ने एक सीधी विधि प्रदान की जिसे त्वचीय तंत्रिका तंतुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृश्य को प्रदर्शित करने और त्वचा में तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के बीच स्थानिक सहसंबंध की कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो सामान्य त्वचा के होमियोस्टेसिस और रोग स्थितियों के तहत त्वचीय परिवर्तन को समझने के लिए बहुत अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन समाशोधन उपचार के साथ मोटे ऊतक वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके बालों वाली और चमकदार त्वचा में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करता है और त्वचा को बेहतर ढ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज इनोवेशन फंड (प्रोजेक्ट कोड नं. सीआई 2021 ए 03404) और राष्ट्रीय पारंपरिक चीनी चिकित्सा अंतःविषय नवाचार निधि (परियोजना कोड सं। ZYYCXTD-डी-202202)।
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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