Tykkelsen på vevsseksjoner begrenset den morfologiske studien av hudens innervering. Den nåværende protokollen beskriver en unik vevsryddingsteknikk for å visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vevsseksjoner under konfokal mikroskopi.
Hud innervering er en viktig del av det perifere nervesystemet. Selv om studien av kutane nervefibre har utviklet seg raskt, kommer det meste av forståelsen av deres fordelingsmessige og kjemiske egenskaper fra konvensjonell histokjemisk og immunhiistokjemisk farging på tynne vevsseksjoner. Med utviklingen av vevsryddingsteknikken har det blitt mulig å se de kutane nervefibrene på tykkere vevsseksjoner. Den nåværende protokollen beskriver flere fluorescerende flekker på vevsseksjoner med en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud av rotte bakfot, de to typiske hårete og glabrøse hudstedene. Her merker calcitoningenrelatert peptid de sensoriske nervefibrene, mens falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 merker henholdsvis blod- og lymfekarene. Under et konfokalt mikroskop ble de merkede sensoriske nervefibrene fulgt helt på lengre avstand, og løp i bunter i det dype kutane laget og freestyle i det overfladiske laget. Disse nervefibrene løp parallelt med eller omringet blodkarene, og lymfekar dannet et tredimensjonalt (3D) nettverk i hårete og glabroushuden. Den nåværende protokollen gir en mer effektiv tilnærming til å studere hud innervering enn de eksisterende konvensjonelle metodene fra metodikkperspektivet.
Huden, det største organet i kroppen, som tjener som et nøkkelgrensesnitt for miljøet, er tett innervated av mange nervefibre 1,2,3. Selv om hudinnvandring har blitt studert mye tidligere med ulike histologiske metoder, for eksempel farging på helmonterte hud- og vevsseksjoner 4,5,6, er den detaljerte effektive demonstrasjonen av kutane nervefibre fortsatt en utfordring 7,8. Gitt dette utviklet den nåværende protokollen en unik teknikk for å vise kutane nervefibre tydeligere i den tykke vevsdelen.
På grunn av grensen ved tykkelsen på seksjoner er observasjonen av innerverte hudnervefibre ikke presis nok til å nøyaktig skildre forholdet mellom calcitonin genrelatert peptid (CGRP) nervefibre og lokale vev og organer fra den oppkjøpte bildeinformasjonen. Fremveksten av 3D-vevsryddingsteknologi gir en mulig metode for å løse dette problemet 9,10. Den raske utviklingen av vevsryddingsmetoder har tilbudt mange verktøy for å studere vevsstrukturer, hele organer, nevronprojeksjoner og hele dyr i nyere tid11. Det gjennomsiktige hudvevet kan avbildes i en mye tykkere del ved konfokal mikroskopi for å få dataene til å visualisere kutane nervefibre.
I den nåværende studien ble plantar og dorsal hud av en rotte bakfot valgt som de to målstedene for hårete og glabrøse hud 3,4,7. For å spore de kutane nervefibrene på lengre avstand, ble hudvevet skiver i tykkelsen på 300 μm for immunhiistokjemisk og histokjemisk farging, etterfulgt av vevsryddingsbehandling. CGRP ble brukt til å merke de sensoriske nervefibrene12,13. I tillegg, for å markere de kutane nervefibrene på vevsbakgrunnen, ble falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 (LYVE1) videre brukt til å merke blodkarene og lymfekarene, henholdsvis14,15.
Disse tilnærmingene ga en enkel metode som kan brukes for å demonstrere en høyoppløselig visning av kutane nervefibre og også å visualisere den romlige korrelasjonen mellom nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i huden, noe som kan gi mye mer informasjon for å forstå homeostase av normal hud og den kutane endringen under de patologiske forholdene.
Den nåværende studien gir en detaljert demonstrasjon av de kutane nervefibrene i den hårete og glabrøse huden ved å bruke immunfluorescens på tykkere vevsseksjoner med ryddingsbehandling og en 3D-visning for å forstå hudens innervasjon bedre. Antistoffinkubasjonstiden på opptil 1-2 dager og en rengjøringsprosess over natten er viktig. Disse to viktige trinnene påvirker direkte immunfluorescensfargingseffekten av tykke seksjoner. Et annet problem ble reist fra valg av antistoffer, ikke alle er egnet for tykke s…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Prosjektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary innovation Fund (Prosjektkodenr. ZYYCXTD-D-202202).
1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |