Demonstrere hårete og glabrøse hudinnvandring i et 3D-mønster ved hjelp av flere fluorescerende fargings- og vevsryddingsmetoder
Summary
Tykkelsen på vevsseksjoner begrenset den morfologiske studien av hudens innervering. Den nåværende protokollen beskriver en unik vevsryddingsteknikk for å visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vevsseksjoner under konfokal mikroskopi.
Abstract
Hud innervering er en viktig del av det perifere nervesystemet. Selv om studien av kutane nervefibre har utviklet seg raskt, kommer det meste av forståelsen av deres fordelingsmessige og kjemiske egenskaper fra konvensjonell histokjemisk og immunhiistokjemisk farging på tynne vevsseksjoner. Med utviklingen av vevsryddingsteknikken har det blitt mulig å se de kutane nervefibrene på tykkere vevsseksjoner. Den nåværende protokollen beskriver flere fluorescerende flekker på vevsseksjoner med en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud av rotte bakfot, de to typiske hårete og glabrøse hudstedene. Her merker calcitoningenrelatert peptid de sensoriske nervefibrene, mens falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 merker henholdsvis blod- og lymfekarene. Under et konfokalt mikroskop ble de merkede sensoriske nervefibrene fulgt helt på lengre avstand, og løp i bunter i det dype kutane laget og freestyle i det overfladiske laget. Disse nervefibrene løp parallelt med eller omringet blodkarene, og lymfekar dannet et tredimensjonalt (3D) nettverk i hårete og glabroushuden. Den nåværende protokollen gir en mer effektiv tilnærming til å studere hud innervering enn de eksisterende konvensjonelle metodene fra metodikkperspektivet.
Introduction
Huden, det største organet i kroppen, som tjener som et nøkkelgrensesnitt for miljøet, er tett innervated av mange nervefibre 1,2,3. Selv om hudinnvandring har blitt studert mye tidligere med ulike histologiske metoder, for eksempel farging på helmonterte hud- og vevsseksjoner 4,5,6, er den detaljerte effektive demonstrasjonen av kutane nervefibre fortsatt en utfordring 7,8. Gitt dette utviklet den nåværende protokollen en unik teknikk for å vise kutane nervefibre tydeligere i den tykke vevsdelen.
På grunn av grensen ved tykkelsen på seksjoner er observasjonen av innerverte hudnervefibre ikke presis nok til å nøyaktig skildre forholdet mellom calcitonin genrelatert peptid (CGRP) nervefibre og lokale vev og organer fra den oppkjøpte bildeinformasjonen. Fremveksten av 3D-vevsryddingsteknologi gir en mulig metode for å løse dette problemet 9,10. Den raske utviklingen av vevsryddingsmetoder har tilbudt mange verktøy for å studere vevsstrukturer, hele organer, nevronprojeksjoner og hele dyr i nyere tid11. Det gjennomsiktige hudvevet kan avbildes i en mye tykkere del ved konfokal mikroskopi for å få dataene til å visualisere kutane nervefibre.
I den nåværende studien ble plantar og dorsal hud av en rotte bakfot valgt som de to målstedene for hårete og glabrøse hud 3,4,7. For å spore de kutane nervefibrene på lengre avstand, ble hudvevet skiver i tykkelsen på 300 μm for immunhiistokjemisk og histokjemisk farging, etterfulgt av vevsryddingsbehandling. CGRP ble brukt til å merke de sensoriske nervefibrene12,13. I tillegg, for å markere de kutane nervefibrene på vevsbakgrunnen, ble falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 (LYVE1) videre brukt til å merke blodkarene og lymfekarene, henholdsvis14,15.
Disse tilnærmingene ga en enkel metode som kan brukes for å demonstrere en høyoppløselig visning av kutane nervefibre og også å visualisere den romlige korrelasjonen mellom nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i huden, noe som kan gi mye mer informasjon for å forstå homeostase av normal hud og den kutane endringen under de patologiske forholdene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende studien gir en detaljert demonstrasjon av de kutane nervefibrene i den hårete og glabrøse huden ved å bruke immunfluorescens på tykkere vevsseksjoner med ryddingsbehandling og en 3D-visning for å forstå hudens innervasjon bedre. Antistoffinkubasjonstiden på opptil 1-2 dager og en rengjøringsprosess over natten er viktig. Disse to viktige trinnene påvirker direkte immunfluorescensfargingseffekten av tykke seksjoner. Et annet problem ble reist fra valg av antistoffer, ikke alle er egnet for tykke s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Prosjektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary innovation Fund (Prosjektkodenr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
Referências
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
