Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Arun Upadhyay; Robert J. Vassar; Jeffrey N. Savas

doi:10.3791/63816

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Artigo de método

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

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DOI:

10.3791/63816

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28 de abril de 2022

Arun Upadhyay¹ , Robert J. Vassar¹ , Jeffrey N. Savas¹

¹Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Resumo

As inclusões fibrilares proteináceas são marcas patológicas fundamentais de múltiplas doenças neurodegenerativas. Nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (DA), peptídeos amilóide-beta formam protofibrilas no espaço extracelular, que agem como sementes que gradualmente crescem e amadurecem em grandes placas amiloides. Apesar dessa compreensão básica, o conhecimento atual da estrutura de fibrila amiloide, composição e padrões de deposição no cérebro é limitado. Uma grande barreira tem sido a incapacidade de isolar fibrilas amiloides altamente purificadas de extratos cerebrais. A purificação de afinidade e as abordagens baseadas em microdissecção de captura a laser foram usadas anteriormente para isolar amiloides, mas são limitadas pela pequena quantidade de material que pode ser recuperada. Este novo protocolo robusto descreve a purificação bioquímica de núcleos de placas amiloides usando solubilização de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) com ultracentrifugação de gradiente de densidade de sacarose e ultrassônicas e produz fibrilas altamente puras de pacientes com DA e tecidos cerebrais modelo AD. A análise proteômica de baixo para cima baseada em espectrometria de massa (MS) do material purificado representa uma estratégia robusta para identificar quase todos os componentes proteicos primários das fibrilas amiloides. Estudos proteômicos anteriores de proteínas na coronária amiloide revelaram uma coleção inesperadamente grande e funcionalmente diversificada de proteínas. Notavelmente, após o refino da estratégia de purificação, o número de proteínas de co-purificação foi reduzido em mais de 10 vezes, indicando a alta pureza do material isolado SDS insolúvel. A coloração negativa e a microscopia eletrônica imuno-ouro permitiram a confirmação da pureza dessas preparações. Outros estudos são necessários para compreender os atributos espaciais e biológicos que contribuem para a deposição dessas proteínas em inclusões amiloides. Em conjunto, essa estratégia analítica está bem posicionada para aumentar a compreensão da biologia amiloide.

Introdução

Amiloide é um arranjo supramolecular extremamente estável que é encontrado em um painel diversificado de proteínas, algumas das quais levam a mudanças patológicas¹. O acúmulo de agregados amiloides intra ou extracelulares é observado em várias doenças neurodegenerativas². Os agregados amiloides são heterogêneos e são enriquecidos com um grande número de proteínas e lipídios³. Nos últimos anos, o interesse pelo proteome amiloide tem gerado interesse substancial entre neurocientistas básicos e translacionais. Vários métodos foram desenvolvidos para extrair e purificar agregados amiloides de tecidos ....