인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩
Summary
여기에 제시된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 된 유 전적으로 일치하는 상피 및 혈관 내피 세포를 통합하여 신장 사구체 여과 장벽의 구조와 기능을 요약하는 개인화 된 장기 온 칩 시스템을 설계하는 프로토콜입니다. 이 생체 공학 시스템은 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.
Abstract
만성 신장 질환(CKD)은 미국 성인 인구의 15%에 영향을 미치지만 인간의 생물학적 반응과 신독성을 정확하게 예측할 수 있는 기능 모델이 부족하여 표적 치료법의 확립이 제한되었습니다. 신장 정밀 의학의 발전은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 확립된 인간 신장 사구체의 시험관내 모델(혈액 여과를 위한 주요 부위이자 많은 질병 및 약물 독성의 주요 표적)은 일반적으로 제한된 기능적 특성과 타의 추종을 불허하는 유전적 배경을 가진 이질적인 세포 집단을 사용합니다. 이러한 특성은 환자 특정 질병 모델링 및 치료 발견에 대한 적용을 크게 제한합니다.
이 논문은 단일 환자의 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 유래 사구체 상피 (podocytes)와 혈관 내피를 통합하여 등성 및 혈관 화 된 미세 유체 신장 사구체 칩을 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 결과 사구체 칩은 줄기 세포 유래 내피 및 상피 세포층으로 구성되어 계통 특이 적 마커를 발현하고 기저막 단백질을 생성하며 신장의 사구체 여과 장벽과 유사한 조직-조직 인터페이스를 형성합니다. 설계된 사구체 칩은 분자를 선택적으로 필터링하고 약물로 인한 신장 손상을 요약합니다. 이소제닉 세포 유형을 사용하여 신장 사구체의 구조와 기능을 재구성하는 능력은 환자 특이성으로 신장 질환을 모델링하고 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 위한 장기 온 칩의 유용성을 발전시킬 수 있는 기회를 제공합니다.
Introduction
Organ-on-a-chip 장치는 분자 및 기계적 자극과 혈관 형성을 사용하여 특정 장기의 구조와 기능을 모델링하는 조직-조직 인터페이스를 형성하는 동적 3D in vitro 모델입니다. 신장의 사구체 (사구체 칩)를 재현하는 것을 목표로하는 이전에 확립 된 organ-on-a-chip 장치는 동물 세포주 1 또는 이종 소스 2,3의 인간1 차 및 불멸화 된 세포주로 구성되었습니다. 유 전적으로 이질적인 세포 공급원의 사용은 환자 특이 적 반응 및 유전학 또는 질병 메커니즘에 대한 연구를 크게 제한하는 변이를 나타냅니다 4,5. 이 문제를 해결하는 것은 시험관 내 모델 2,3,6 엔지니어링을 위한 보다 정확한 미세 환경을 제공하기 위해 보존된 분자 및 유전적 프로필을 가진 특정 개체에서 유래하는 등종 세포주의 가용성에 달려 있습니다. 인간 기원의 이소겐 세포주는 이제 인간 iPS 세포 배양의 발전으로 인해 쉽게 생성될 수 있습니다. 인간 iPS 세포는 전형적으로 비침습적으로 공급되고, 무기한으로 자가 갱신될 수 있고, 거의 모든 세포 유형으로 분화하기 때문에, 이들은 사구체 칩 7,8과 같은 시험관내 모델의 확립을 위한 매력적인 세포 공급원 역할을 한다. 사구체 여과 장벽은 혈액 여과의 주요 부위입니다. 혈액은 먼저 사구체 기저막인 혈관 내피를 통해 여과되고 마지막으로 족세포라는 특수 상피를 통해 여과됩니다. 여과 장벽의 세 가지 구성 요소 모두 분자의 선택적 여과에 기여합니다. 여기에 제시된 것은 단일 인간 iPS 세포 공급원으로부터 혈관 내피 및 사구체 상피와 인터페이스되는 장기 온 칩 장치를 확립하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 사구체 여과 장벽을 재현하기 위해 등종 및 혈관 화 칩을 설계하는 데 특히 유용하지만, 동종 성 ‘바디 온 칩’시스템과 같은 다른 유형의 개인화 된 장기 온 칩 및 다중 기관 플랫폼을 개발하기위한 청사진도 제공합니다.
본원에 기재된 프로토콜은 인간 iPS 세포를 2개의 별개의 혈통 – 측면 중배엽 및 중배엽 세포로 발산하는 것으로 시작하고, 이들은 연속적으로 각각 혈관 내피 및 사구체 상피로 분화된다. 측면 중배엽 세포를 생성하기 위해, 인간 iPS 세포를 기저막 매트릭스 1-코팅된 플레이트에 시딩하고, Wnt 활성제, CHIR 99021 및 강력한 중배엽 유도제인 뼈-형태형성 4(BMP4)가 보충된 N2B27 배지에서 3일(배지 교환 없이) 배양하였다. 생성된 측면 중배엽 세포는 이전에 근접(T), 혼합 쌍형 호메오박스(MIXL) 및 에오메소더민(EOMES)의 발현을 특징으로 했습니다.9. 이어서, 측면 중배엽 세포를 VEGF165 및 포스콜린이 보충된 배지에서 4일 동안 배양하여 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 VE-카데린 및/또는 PECAM-1 발현에 기초하여 분류된 혈관 내피 세포를 유도하였다. 생성된 혈관 내피 세포 (viEC)를 미세유체 장치에서 파종할 준비가 될 때까지 기저막 매트릭스 3-코팅된 플라스크 상에서 배양함으로써 확장시켰다.
중배엽 세포를 생성하기 위해, 인간 iPS 세포를 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트에 시딩하고, 액티빈 A 및 CHIR99021을 함유하는 배지에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 중배엽 세포는 이전에 기술된 바와 같이 HAND1, 구스코이드 및 상완골(T)의 발현을 특징으로 하였다 2,10,11. 중간 중배엽 (IM) 세포 분화를 유도하기 위해, 중배엽 세포를 BMP-7 및 CHIR99021이 보충된 배지에서 14일 동안 배양하였다. 생성된 IM 세포는 Wilm 종양 1 (WT1), 쌍을 이루는 상자 유전자 2 (PAX2) 및 홀수 건너뛴 관련 단백질 1 (OSR-1)2,10,11을 발현합니다.
2채널 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 미세유체 칩은 시험관 내에서 사구체 여과 장벽의 구조를 요약하도록 설계되었습니다. 비뇨기 채널은 1,000 μm x 1,000 μm (w x h)이고 모세관 채널 치수는 1,000 μm x 200 μm (w x h)입니다. 주기적 스트레칭 및 이완 주기는 유체 채널의 각 측면에 존재하는 중공 챔버에 의해 촉진되었습니다. 세포를 비뇨기 및 모세관 채널을 분리하는 유연한 PDMS 막(두께 50μm)에 시딩했습니다. 멤브레인에는 육각형 기공(직경 7μm, 간격 40μm)이 있어 세포 간 신호 전달을 촉진하는 데 도움이 됩니다(그림 1A)2,12. IM 유도가 완료되기 이틀 전에, 마이크로유체 칩을 기저막 매트릭스 2로 코팅하였다. viEC는 IM 유도가 완료되기 1일 전에 내피 유지 배지를 사용하여 미세유체 칩의 모세관 채널에 시딩하고, ECM 코팅된 PDMS 멤브레인의 기저부에서 세포 접착을 가능하게 하기 위해 칩을 거꾸로 뒤집었습니다. IM 유도가 완료된 날에, 세포를 BMP7, 액티빈 A, CHIR99021, VEGF165, 및 모든 트랜스레티노산이 보충된 배지를 사용하여 마이크로유체 칩의 비뇨기 채널 내로 시딩하여 칩 내 족세포 분화를 유도하였다. 다음날, 배지 저장소를 Podocyte 유도 배지 및 내피 유지 배지로 채우고 0.4Hz에서 10 % 기계적 변형 및 유체 흐름 (60μL / h)을 칩에 적용했습니다.
세포화된 미세유체 칩을 Podocyte 유도 배지(비뇨기 채널 내) 및 내피 유지 배지(혈관 채널 내)를 사용하여 추가로 5일 동안 배양하였다. 생성된 신장 사구체 칩을 족세포 및 내피 세포 모두에 대한 유지 배지에서 최대 7일 동안 추가로 배양하였다. 분화된 족세포는 포도신 및 네프린 13,14를 포함한 계통 특이적 단백질을 양성으로 발현한 반면, viEC는 혈통 식별 단백질 PECAM-1 및 VE-Cadherin을 양성으로 발현했으며, 이들 모두는 사구체 여과 장벽 15,16의 무결성을 유지하는 데 필수적인 분자입니다. . 족세포와 viEC는 모두 조직 성숙과 기능에도 중요한 가장 풍부한 사구체 기저막 단백질인 콜라겐 IV를 분비하는 것으로 밝혀졌습니다.
사구체 칩의 여과 장벽 (내피, 기저막 및 상피)의 3 성분 시스템은 분자를 선택적으로 필터링하고 화학 요법, 신 독성 약물 치료에 반응하는 것으로 밝혀졌습니다. 약물 치료 결과는 사구체 칩이 신 독성 연구 및 질병 모델링에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 등종 iPS 세포 유도체로부터 기능성 미세유체 신장 사구체 칩을 엔지니어링하기 위한 일반적인 지침을 제공합니다. 엔지니어링 칩의 다운스트림 분석은 연구원이 원하는 대로 수행할 수 있습니다. 사구체 칩을 사용하여 약물로 인한 사구체 손상을 모델링하는 방법에 대한 자세한 내용은 이전 간행물 2,12를 참조하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서는 동종 인간 iPS 세포주에서 혈관 내피 및 사구체 상피(족세포)를 유도하는 프로토콜과 이러한 세포를 사용하여 신장 사구체의 구조, 조직-조직 인터페이스 및 분자 여과 기능을 모방하는 3D 장기 온 칩 시스템을 설계하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 사구체 칩에는 내피와 사구체 상피가 장착되어 있어 함께 분자를 선택적으로 필터링하는 장벽을 제공합니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 듀크 대학의 프랫 공과 대학, 듀크 의과 대학의 신장학과, 생물 의학 연구의 화이트 헤드 장학금 및 S. Musah의 Genentech 연구 상이 지원했습니다. Y. Roye는 듀크 대학교 의생명공학과에서 듀크 대학교-알프레드 P. 슬론 재단 장학금과 윌리엄 M. “몬티” 라이커트 대학원 펠로우십을 받고 있습니다. DU11 (Duke University 클론 #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 저자는 기술 지원과 유용한 토론에 대해 N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya 및 Y. Zhou에게 감사드립니다. 저자는 또한 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Musah Lab 회원들에게 감사드립니다. 저자는 Acuri C6 유세포분석기를 선물한 Segura Lab에 감사를 표합니다.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| Collagen IV | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R&D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basement membrane matrices | |||
| Corning Fibronectin, Human | Corning | 356008 | Basement membrane (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | Iwai North America | N8922012 | Basement membrane matrix (2) |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019) | ||
| Culture medium growth factors and media supplements | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoic acid (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 serum-free supplement | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 supplement (50x) without Vitamin A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | May show lot-to-lot variation |
| Complete medium kit with CultureBoost-R | Cell Systems | 4Z0-500-R | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12 with glutamine |
| Forskolin (Adenylyl cyclase activator) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 35050061 | glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparin solution | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| Human BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 05850 | Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal media | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Lateral mesoderm basal media |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-streptomycin, liquid (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months. |
| TGF-Beta inhibitor (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzymes and other reagents | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Cell detachment buffer |
| Dimethyl Suloxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| Sterile distilled water | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0.05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) Hub module | Emulate | ORB-HM1 | |
| 100mm x 15 mm round petri dish | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm square cell culture dish | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | Corning | 29442-462 | |
| Aspirating Unit | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Centrifuge | Beckman Coulter | B99516 | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells. |
| Hemocytometer | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, large | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 Upright Confocal Microscope | |||
| Media reservoir (POD Portable Module) | Emulate | POD-1 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Organ-chip | Emulate | S-1 Chip | |
| Organ-chip holder | Emulate | AK-CCR | |
| P10 precision barrier pipette tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| Plasma Asher | Quorum tech | K1050X RF | This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF). |
| Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Corning | 352235 | |
| Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped | Corning | 356551 | |
| Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped | Corning | 356525 | |
| Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 µm, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile Microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 cell culture flask with vent cap | Corning | 430641U | |
| Tissue culture-treated 12 well plates | Corning | 353043 | |
| Tissue culture-treated 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) | Emulate | ZOE-CM1 | Organ Chip Bioreactor |
| VE-Cadherin CD144 anti-human antibody – APC conjugated | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Wide-beveled cell lifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referências
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