Isogen njure glomerulus chip konstruerad från humaninducerade pluripotenta stamceller
Summary
Här presenteras ett protokoll för att konstruera ett personligt organ-på-ett-chip-system som rekapitulerar strukturen och funktionen hos njurglomerulär filtreringsbarriär genom att integrera genetiskt matchade epitel- och vaskulära endotelceller differentierade från humaninducerade pluripotenta stamceller. Detta biotekniska system kan främja njurprecisionsmedicin och relaterade applikationer.
Abstract
Kronisk njursjukdom (CKD) drabbar 15% av den amerikanska vuxna befolkningen, men etableringen av riktade terapier har begränsats av bristen på funktionella modeller som exakt kan förutsäga mänskliga biologiska svar och nefrotoxicitet. Framsteg inom njurprecisionsmedicin kan hjälpa till att övervinna dessa begränsningar. Tidigare etablerade in vitro-modeller av den mänskliga njurglomerulusen – den primära platsen för blodfiltrering och ett viktigt mål för många sjukdomar och läkemedelstoxiciteter – använder emellertid vanligtvis heterogena cellpopulationer med begränsade funktionella egenskaper och oöverträffad genetisk bakgrund. Dessa egenskaper begränsar signifikant deras tillämpning för patientspecifik sjukdomsmodellering och terapeutisk upptäckt.
Detta papper presenterar ett protokoll som integrerar humant inducerat pluripotent stam (iPS) cell-härledd glomerulärt epitel (podocyter) och vaskulärt endotel från en enda patient för att konstruera ett isogent och vaskulariserat mikrofluidiskt njurglomeruluschip. Det resulterande glomeruluschipet består av stamcellsderiverade endotel- och epitelcellskikt som uttrycker härstamningsspecifika markörer, producerar källarmembranproteiner och bildar ett vävnads-vävnadsgränssnitt som liknar njurens glomerulära filtreringsbarriär. Det konstruerade glomeruluschipet filtrerar selektivt molekyler och rekapitulerar läkemedelsinducerad njurskada. Förmågan att rekonstituera strukturen och funktionen hos njurglomerulus med hjälp av isogena celltyper skapar möjlighet att modellera njursjukdom med patientspecificitet och främja nyttan av organ-on-chips för njurprecisionsmedicin och relaterade applikationer.
Introduction
Organ-on-a-chip-enheter är dynamiska 3D-in vitro-modeller som använder molekylär och mekanisk stimulering, såväl som vaskularisering, för att bilda vävnads-vävnadsgränssnitt som modellerar strukturen och funktionen hos specifika organ. Tidigare etablerade organ-on-a-chip-enheter som syftade till att rekapitulera njurens glomerulus (glomeruluschips) bestod av djurcellinjer1 eller mänskliga primära och odödliga cellinjer av heterogena källor 2,3. Användningen av genetiskt heterogena cellkällor uppvisar variationer som avsevärt begränsar studierna av patientspecifika svar och genetik eller sjukdomsmekanismer 4,5. Att ta itu med denna utmaning beror på tillgången på isogena cellinjer från specifika individer med bevarade molekylära och genetiska profiler för att ge en mer exakt mikromiljö för konstruktion av in vitro-modeller 2,3,6. Isogena cellinjer av mänskligt ursprung kan nu enkelt genereras på grund av framsteg inom human iPS-cellodling. Eftersom mänskliga iPS-celler vanligtvis är icke-invasivt anskaffade, kan förnya sig själv på obestämd tid och differentieras till nästan vilken celltyp som helst, fungerar de som en attraktiv källa till celler för etablering av in vitro-modeller, såsom glomerulus-chipet 7,8. Den glomerulära filtreringsbarriären är den primära platsen för blodfiltrering. Blod filtreras först genom vaskulärt endotel, det glomerulära källarmembranet och slutligen genom specialiserade epitel som heter podocyter. Alla tre komponenterna i filtreringsbarriären bidrar till selektiv filtrering av molekyler. Här presenteras ett protokoll för att upprätta en organ-på-ett-chip-enhet som är gränssnitt med vaskulärt endotel och glomerulärt epitel från en enda mänsklig iPS-cellkälla. Även om detta protokoll är särskilt användbart för att konstruera ett isogent och vaskulärt chip för att rekapitulera den glomerulära filtreringsbarriären, ger det också en plan för att utveckla andra typer av personliga organ-på-chips och plattformar med flera organ, såsom ett isogent “kropp-på-ett-chip” -system.
Protokollet som beskrivs häri börjar med divergerande differentiering av humana iPS-celler i två separata linjer – laterala mesoderm- och mesodermceller, som därefter differentieras till vaskulärt endotel respektive glomerulärt epitel. För att generera laterala mesodermceller såddes humana iPS-celler på källarmembranmatris 1-belagda plattor och odlades i 3 dagar (utan medieutbyte) i N2B27-medium kompletterat med Wnt-aktivatorn, CHIR 99021, och den potenta mesoderminduceraren, benmorfogenetisk 4 (BMP4). De resulterande laterala mesodermcellerna kännetecknades tidigare av uttrycket av brachyury (T), mixparad som homeobox (MIXL) och eomesodermin (EOMES)9. Därefter odlades de laterala mesodermcellerna i 4 dagar i ett medium kompletterat med VEGF165 och Forskolin för att inducera vaskulära endotelceller som sorterades ut baserat på VE-Cadherin och / eller PECAM-1-uttryck med hjälp av magnetaktiverad cellsortering (MACS). De resulterande vaskulära endotelcellerna (viEC) expanderades genom att odla dem på källarmembranmatris 3-belagda kolvar tills de var redo att fröas i den mikrofluidiska anordningen.
För att generera mesodermceller såddes humana iPS-celler på källarmembranmatris 2-belagda plattor och odlades i 2 dagar i ett medium innehållande Activin A och CHIR99021. De resulterande mesodermcellerna kännetecknades av uttrycket av HAND1, goosecoid och brachury (T) som beskrivits tidigare 2,10,11. För att inducera mellanliggande mesoderm (IM) celldifferentiering odlades mesodermcellerna i 14 dagar i ett medium kompletterat med BMP-7 och CHIR99021. De resulterande IM-cellerna uttrycker Wilms tumör 1 (WT1), parad boxgen 2 (PAX2) och udda överhoppat relaterat protein 1 (OSR-1)2,10,11.
Ett tvåkanaligt polydimetylsiloxan (PDMS) -baserat mikrofluidiskt chip utformades för att rekapitulera strukturen hos den glomerulära filtreringsbarriären in vitro. Urinkanalen är 1 000 μm x 1 000 μm (b x h) och kapillärkanaldimensionen är 1 000 μm x 200 μm (w x h). Cykliska sträcknings- och avslappningscykler underlättades av de ihåliga kamrarna som finns på varje sida av de fluidiska kanalerna. Cellerna såddes på ett flexibelt PDMS-membran (50 μm tjockt) som separerar urin- och kapillärkanalerna. Membranet är utrustat med sexkantiga porer (7 μm diameter, 40 μm från varandra) för att främja intercellulär signalering (figur 1A)2,12. Två dagar innan IM-induktionen var klar belades de mikrofluidiska chipsen med källarmembranmatris 2. viECs såddes in i kapillärkanalen i det mikrofluidiska chipet med hjälp av endotelunderhållsmedium 1 dag innan IM-induktionen var klar och chipet vändes upp och ner för att möjliggöra celladhesion på basalsidan av det ECM-belagda PDMS-membranet. Samma dag som IM-induktionen slutfördes såddes cellerna in i urinkanalen i det mikrofluidiska chipet med hjälp av ett medium kompletterat med BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 och all trans retinsyra för att inducera podocytdifferentiering i chipet. Följande dag fylldes mediebehållarna med Podocyte Induction medium och Endothelial Maintenance medium, och 10% mekanisk belastning vid 0,4 Hz och vätskeflöde (60 μL / h) applicerades på chipsen.
De cellulariserade mikrofluidiska chipsen odlades i ytterligare 5 dagar med användning av Podocyte Induction medium (i urinkanalen) och endotelunderhållsmedium (i kärlkanalen). De resulterande njurglomeruluschipsen odlades i upp till 7 ytterligare dagar i underhållsmedier för både podocyt- och endotelcellerna. De differentierade podocyterna uttryckte positivt härstamningsspecifika proteiner, inklusive podocin och nefrin 13,14, medan viECs positivt uttryckte härstamningsidentifieringsproteinerna PECAM-1 och VE-Cadherin, som alla är väsentliga molekyler för att upprätthålla integriteten hos den glomerulära filtreringsbarriären 15,16 . Podocyterna och viECs visade sig båda utsöndra det vanligaste glomerulära källarmembranproteinet, kollagen IV, vilket också är viktigt för vävnadsmognad och funktion.
Trekomponentsystemet i filtreringsbarriären – endotel, källarmembran och epitel – i glomeruluschipsen befanns selektivt filtrera molekyler och svara på en kemoterapeutisk, nefrotoxisk läkemedelsbehandling. Resultat från läkemedelsbehandlingen indikerade att glomeruluschipet kan användas för nefrotoxicitetsstudier och för sjukdomsmodellering. Detta protokoll ger den allmänna riktlinjen för konstruktion av ett funktionellt mikrofluidiskt njurglomeruluschip från isogena iPS-cellderivat. Nedströmsanalyser av det konstruerade chipet kan utföras enligt forskarens önskemål. För mer information om hur du använder glomeruluschipet för att modellera läkemedelsinducerad glomerulär skada, se tidigare publikationer 2,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport beskriver vi ett protokoll för att härleda vaskulärt endotel och glomerulärt epitel (podocyter) från en isogen human iPS-cellinje och användningen av dessa celler för att konstruera ett 3D-organ-på-ett-chip-system som efterliknar strukturen, vävnadsgränssnittet och molekylär filtreringsfunktion hos njurglomerulus. Detta glomeruluschip är utrustat med endotel och glomerulärt epitel som tillsammans ger en barriär för selektivt filtrerande molekyler.
Forskare som ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Pratt school of Engineering vid Duke University, avdelningen för nefrologi vid Duke Department of Medicine, ett Whitehead-stipendium i biomedicinsk forskning och ett Genentech Research Award för S. Musah. Y. Roye är mottagare av Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship och William M. “Monty” Reichert Graduate Fellowship från Duke University’s Department of Biomedical Engineering. DU11 (Duke University klon #11) iPS-cellinjen genererades vid Duke iPSC Core Facility och tillhandahölls oss av Bursac Lab vid Duke University. Författarna tackar N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya och Y. Zhou för tekniskt bistånd och hjälpsamma diskussioner. Författarna vill också tacka medlemmarna i Musah Lab för hjälpsamma kommentarer om manuskriptet. Författarna tackar Segura Lab för gåvan av en Acuri C6 flödescytometer.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| Collagen IV | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R&D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basement membrane matrices | |||
| Corning Fibronectin, Human | Corning | 356008 | Basement membrane (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | Iwai North America | N8922012 | Basement membrane matrix (2) |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019) | ||
| Culture medium growth factors and media supplements | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoic acid (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 serum-free supplement | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 supplement (50x) without Vitamin A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | May show lot-to-lot variation |
| Complete medium kit with CultureBoost-R | Cell Systems | 4Z0-500-R | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12 with glutamine |
| Forskolin (Adenylyl cyclase activator) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 35050061 | glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparin solution | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| Human BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 05850 | Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal media | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Lateral mesoderm basal media |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-streptomycin, liquid (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months. |
| TGF-Beta inhibitor (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzymes and other reagents | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Cell detachment buffer |
| Dimethyl Suloxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| Sterile distilled water | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0.05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) Hub module | Emulate | ORB-HM1 | |
| 100mm x 15 mm round petri dish | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm square cell culture dish | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | Corning | 29442-462 | |
| Aspirating Unit | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Centrifuge | Beckman Coulter | B99516 | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells. |
| Hemocytometer | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, large | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 Upright Confocal Microscope | |||
| Media reservoir (POD Portable Module) | Emulate | POD-1 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Organ-chip | Emulate | S-1 Chip | |
| Organ-chip holder | Emulate | AK-CCR | |
| P10 precision barrier pipette tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| Plasma Asher | Quorum tech | K1050X RF | This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF). |
| Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Corning | 352235 | |
| Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped | Corning | 356551 | |
| Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped | Corning | 356525 | |
| Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 µm, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile Microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 cell culture flask with vent cap | Corning | 430641U | |
| Tissue culture-treated 12 well plates | Corning | 353043 | |
| Tissue culture-treated 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) | Emulate | ZOE-CM1 | Organ Chip Bioreactor |
| VE-Cadherin CD144 anti-human antibody – APC conjugated | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Wide-beveled cell lifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referências
- Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
- Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
- Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
- Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
- Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
- Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
- Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
- Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
- Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
- Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
- Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).
