Summary
Injeções intravítreas foram realizadas no olho de ovelha com o objetivo de fornecer terapia gênica mediada por vírus para a retina.
Abstract
Existem vários métodos para a entrega de agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que preenche a câmara posterior do olho e mantém a forma do globo ocular. Embora a via IVT seja menos especificamente direcionada do que o parto sub-retiniano, é muito menos invasiva e é amplamente utilizada em ambientes clínicos para uma série de doenças oculares.
Demonstramos anteriormente a eficácia da entrega intravítrea de um produto de terapia gênica mediado por vírus adenoassociado (AAV) (AAV9. CLN5) em ovinos com uma forma natural de CLN5 de lipofuscinose ceróide neuronal (NCL). As ovelhas afetadas receberam terapia genética IVT em um olho, com o outro olho não tratado servindo como um controle interno. A estrutura e a função da retina foram mantidas no olho tratado até 15 meses após o tratamento, enquanto o olho não tratado apresentou função progressivamente declinante e atrofia grave durante o exame post-mortem. Com base nos estudos com ovelhas, o produto de terapia genética CLN5 foi liberado como um candidato a novo medicamento experimental (IND) pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos em setembro de 2021. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a entrega de TVI de um vetor viral terapêutico ao olho ovino.
Introduction
Vários métodos podem ser usados para fornecer agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. Cada via de administração envolve a superação de barreiras como a barreira sangue-retina ou as membranas limitantes internas e externas e tem taxas variadas de eficácia dependendo do fármaco a ser administrado e do alvo específico da retina 1,2.
A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que ocupa a câmara posterior do olho. A principal função do humor vítreo é manter a forma do globo ocular e manter os tecidos oculares, como a lente e a retina, no lugar. O humor vítreo é composto em grande parte de água, com pequenas quantidades de colágeno, ácido hialurônico e outras proteínas não colágenas3. A injeção de TVI é um procedimento simples e comum usado rotineiramente para tratar uma ampla gama de condições oculares, incluindo degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, retinopatia diabética, oclusão da veia retiniana e várias distrofias hereditárias da retina 4,5.
Lipofuscinoses ceroides neuronais (NCL; Doença de Batten) é um grupo de doenças fatais de armazenamento lisossômico que causam degeneração grave do cérebro e da retina. Atualmente, existem 13 variantes conhecidas de NCL resultantes de mutações em diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afetam predominantemente crianças, mas têm idades variadas de início e gravidade da doença6. As NCLs compartilham sintomas progressivos comuns, incluindo declínio cognitivo e motor, convulsões e perda de visão. Não há cura para a NCL; no entanto, a terapia de reposição enzimática dirigida pelo cérebro está atualmente em ensaios clínicos para a doença CLN27,8, e a terapia gênica mediada por AAV tem se mostrado grande promessa em estudos pré-clínicos, com um ensaio clínico para a terapia gênica CLN5 esperado para começar em 2022 9,10.
Muitas outras espécies desenvolvem formas naturais de NCL, incluindo gatos, cães, ovelhas e vacas. Dois modelos ovinos de NCL estão atualmente em estudo ativo na Nova Zelândia: um modelo de doença CLN5 em ovinos de Borderdale e um modelo de doença CLN6 em ovinos de South Hampshire. Os ovinos afetados apresentam muitas das características clínicas e patológicas da doença humana, incluindo atrofia retiniana e perda de visão10,11. Embora a terapia gênica CLN5 dirigida pelo cérebro em ovinos com doença CLN5 possa prevenir ou deter a atrofia cerebral e o declínio clínico, as ovelhas tratadas ainda perdem a visão9. Isso evidenciou a necessidade de tratar a retina para preservar a visão e manter uma melhor qualidade de vida, levando ao estabelecimento de um protocolo de terapia gênica ocular em ovinos.
O olho de ovelha representa um bom modelo do olho humano devido à sua semelhança nas dimensões do globo ocular, volume vítreo e estrutura da retina10,12,13. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a administração de TVI de um pequeno volume (≤100 μL) de vetor viral terapêutico ao olho ovino.
Protocol
Representative Results
Discussion
As injeções intravítreas são um dos procedimentos cirúrgicos mais comuns na oftalmologia humana e provaram ser eficazes na administração de terapias genéticas mediadas por AAV para a retina de ovinos. Já havíamos demonstrado anteriormente a eficácia do AAV9. A terapia gênica com CLN5 foi administrada intravitrealmente na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL15. Espera-se que a tradução desta via de administração para pacientes humanos com NCL t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por sua assistência no estabelecimento desse protocolo e na realização das injeções descritas por Murray et al.15. Os autores também reconhecem o financiamento da CureKids New Zealand, da Canterbury Medical Research Foundation, da Neurogene Inc e da Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
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