Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu
Summary
Protokol, disseke edilmiş fare embriyo yüz süreçlerinden veya kültürlenmiş fare embriyonik palatal mezenkim hücrelerinden tüm hücre protein lizatlarını izole etmek ve fosforile protein seviyelerini değerlendirmek için müteakip batı lekelemesini gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.
Abstract
Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Burada, memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında proteinlerin fosforilasyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bağlamların iki örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri. Protein izolasyonu sırasında ortak defosforilasyon bariyerini aşmak için, fosfoproteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, tüm hücre protein lizatlarının batı lekelenmesini takiben fosfoproteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli fosfoproteinlerin dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.
Introduction
Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Farede, bu süreç embriyonik günde (E) 9.5’te, frontonazal belirginliğin oluşumu ve her biri göç sonrası kraniyal nöral krest hücreleri içeren maksiller ve mandibuler süreçlerin çiftleri ile başlar. Lateral ve medial burun süreçleri, burun çukurlarının görünümü ile frontonazal belirginlikten kaynaklanır ve sonunda burun deliklerini oluşturmak için kaynaşır. Ayrıca, medial burun süreçleri ve maksiller süreçler üst dudağı oluşturmak için kaynaşır. Aynı zamanda, palatogenez, E11.5’teki maksiller süreçlerin oral tarafından farklı çıkıntıların – ikincil damak raflarının – oluşumu ile başlatılır. Zamanla, damak rafları dilin her iki tarafında aşağı doğru büyür, dilin üzerinde zıt bir konuma yükselir ve sonunda burun ve ağız boşluklarını E16.51 ile ayıran sürekli bir damak oluşturmak için orta hatta kaynaşır.
Kraniofasiyal gelişim boyunca bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Örneğin, kemik morfogenetik protein reseptörleri (BMPR’ler) ve çeşitli reseptör tirozin kinaz (RTK) aileleri de dahil olmak üzere dönüştürücü büyüme faktörü (TGF)-β reseptörlerinin alt aileleri gibi hücre zarı reseptörleri, kranial nöral krest hücrelerinde ligand bağlanması ve aktivasyonu üzerine otofosforile edilir 2,3,4 . Ek olarak, G proteinine bağlı transmembran reseptörü Smoothized, kraniyal nöral krest hücrelerinde fosforile olur ve Patched1 reseptörüne bağlanan Sonik kirpi (SHH) ligandının aşağı yönünde kraniyofasiyal ektoderm haline gelir ve siliyer membranda Düzgünleştirilmiş birikim ve SHH yolu aktivasyonu5 ile sonuçlanır. Bu tür ligand-reseptör etkileşimleri, kraniyofasiyal bağlamlarda otokrin, parakrin ve / veya jukstacrin sinyalizasyonu yoluyla ortaya çıkabilir. Örneğin, BMP6’nın kondrosit farklılaşması6 sırasında otokrin bir şekilde sinyal verdiği bilinirken, fibroblast büyüme faktörü (FGF) 8, faringeal ark ektoderminde ifade edilir ve faringeal ark mezenkiminde eksprese edilen FGF RTK ailesinin üyelerine parakrin bir şekilde bağlanır7, 8,9,10. Ayrıca, Kraniofasiyal iskelet gelişimi sırasında hem kondrositlerde hem de osteoblastlarda, transmembran Delta ve / veya Pürüzlü ligandlar komşu hücrelerdeki transmembran Çentik reseptörlerine bağlandığında, daha sonra parçalanan ve fosforile edilen yan yana takrin sinyallemesi yoluyla aktive edilir11. Bununla birlikte, hem otokrin hem de parakrin sinyallemede işlev görme esnekliğine sahip kraniyofasiyal gelişim için önemli olan başka ligand ve reseptör çiftleri de vardır. Örnek olarak, murin diş morfogenezi sırasında, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF)-AA ligandının, emaye organ epiteli12’deki RTK PDGFRa’yı aktive etmek için otokrin bir şekilde sinyal verdiği gösterilmiştir. Buna karşılık, gebeliğin ortasındaki murin fasiyal süreçlerinde, PDGF-AA ve PDGF-CC ligandlarını kodlayan transkriptler kraniyofasiyal ektodermde eksprese edilirken, PDGFRα reseptörü altta yatan kranial nöral krest kaynaklı mezenkimde eksprese edilir ve parakrin sinyalizasyonu13,14,15,16,17 ile sonuçlanır. . Sinyal mekanizmasından bağımsız olarak, bu reseptör fosforilasyon olayları genellikle mitojenle aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolu18,19 gibi hücre içi kinaz kaskadlarını başlatmak için sıklıkla fosforile haline gelen adaptör proteinlerinin ve / veya sinyal moleküllerinin işe alınmasıyla sonuçlanır.
Bu kaskadların terminal hücre içi efektörleri daha sonra transkripsiyon faktörleri, RNA bağlanması, hücre iskeleti ve hücre dışı matriks proteinleri gibi bir dizi substratı fosforile edebilir. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24,Gli1-3 25 ve Sox9 26, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilen transkripsiyon faktörleri arasındadır. Bu translasyonel sonrası modifikasyon (PTM), diğer aktivitelerin yanı sıra alternatif PTM’lere duyarlılığı, dimerizasyonu, stabiliteyi, bölünmeyi ve / veya DNA bağlayıcı afiniteyi doğrudan etkileyebilir20,21,25,26. Ek olarak, RNA bağlayıcı protein Srsf3, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilir ve nükleer translokasyonuna yol açar27. Genel olarak, RNA bağlayıcı proteinlerin fosforilasyonunun, hücre altı lokalizasyonlarını, protein-protein etkileşimlerini, RNA bağlanmasını ve / veya dizi özgüllüğünü etkilediği gösterilmiştir28. Ayrıca, aktomiyozinin fosforilasyonu, kraniyofasiyal gelişim boyunca sitoiskelet yeniden düzenlemelerine yol açabilir29,30 ve küçük integrin bağlayıcı ligand N’ye bağlı glikoproteinler gibi hücre dışı matriks proteinlerinin fosforilasyonu, iskelet gelişimi sırasında biyomineralizasyona katkıda bulunur 31. Yukarıdaki ve diğer birçok örnekle, kraniyofasiyal gelişim sırasında protein fosforilasyonu için geniş etkileri olduğu açıktır. Ek bir düzenleme seviyesi ekleyerek, protein fosforilasyonu, fosfat gruplarını çıkararak kinazlara karşı koyan fosfatazlar tarafından daha da modüle edilir.
Hem reseptör hem de efektör molekül seviyelerindeki bu fosforilasyon olayları, sinyal yolaklarının yayılması için kritik öneme sahiptir ve sonuçta çekirdekteki gen ekspresyonunda değişikliklere neden olarak, göç, proliferasyon, hayatta kalma ve farklılaşma gibi spesifik hücre aktivitelerini yönlendirerek memeli yüzünün düzgün oluşumuna neden olur. Kinazlar ve fosfatazlarla protein etkileşimlerinin bağlam özgüllüğü, PTM’lerde ortaya çıkan değişiklikler ve bunların hücre aktivitesi üzerindeki etkileri göz önüne alındığında, fosforilasyon olaylarının kraniyofasiyal gelişime katkısının tam olarak anlaşılması için bu parametrelerin fizyolojik olarak ilgili bir ortamda incelenmesi kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin fosforilasyonunu ve dolayısıyla memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyal yolaklarının aktivasyonunu incelemek için iki bağlam örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri – hem birincil32 hem de ölümsüzleştirilmiş33 . E11.5’te, maksiller süreçler lateral ve medial nazal süreçler1 ile kaynaşma sürecindedir, böylece fare kraniyofasiyal gelişimi sırasında kritik bir zaman noktasını temsil eder. Ayrıca, maksiller süreçler ve damak raflarından türetilen hücreler burada seçilmiştir, çünkü ikinci yapılar birincisinin türevleridir, böylece araştırmacılara protein fosforilasyonunu in vivo ve in vitro olarak ilgili bağlamlarda sorgulama fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol alternatif yüz süreçleri ve gelişimsel zaman noktaları için de geçerlidir.
Fosforile proteinlerin incelenmesinde kritik bir sorun, protein izolasyonu sırasında bol miktarda çevresel fosfatazlar tarafından kolayca fosforilden arındırılmalarıdır. Bu engelin üstesinden gelmek için, fosforile proteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, fosforile proteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli sinyal yolaklarının dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, araştırmacıların kraniyofasiyal gelişim sırasında kritik fosforilasyona bağımlı sinyal olaylarını sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde araştırmalarını sağlar. Bu protokolde, verilerin uygun şekilde toplanmasını ve sonuçların analizini sağlayan birkaç kritik adım vardır. Fosfoproteinleri fare yüz süreçlerinden ve / veya kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden izole etmek olsun, tüm reaktifleri ve malzemeleri belirtildiğinde buz üzerinde tutarken hızlı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
129S4 fareleri, Sina Dağı’ndaki Icahn Tıp Fakültesi’nden Dr. Philippe Soriano’nun bir hediyesiydi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) / Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIDCR) R01 DE027689 ve K02 DE028572’den K.A.F.’ye, F31 DE029976’dan M.A.R.’ye ve F31 DE029364’ten B.J.C.D.’ye sağlanan fonlarla desteklenmiştir.
Materials
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca – 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
- Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
- Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
- MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
- Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
- Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
- Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
- Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
- Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
- Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
- Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
- Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
- Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
- Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
- Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
- Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
- Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
- Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
- Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
- Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
- Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
- Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
- Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
- . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
- Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
- Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
- Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
- Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).
