Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse
Summary
Das Protokoll stellt eine Methode zur Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus sezierten Gesichtsbehandlungen von Mausembryonen oder kultivierten embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus und zur Durchführung eines anschließenden Western Blotting zur Beurteilung des phosphorylierten Proteinspiegels vor.
Abstract
Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Diese morphologischen Veränderungen werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Hier werden zwei Beispiele für physiologisch relevante Kontexte zur Untersuchung der Phosphorylierung von Proteinen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren gegeben: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale Gaumendickkörperzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen. Um die übliche Barriere der Dephosphorylierung während der Proteinisolierung zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung von Phosphoproteinen ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung von Phosphoproteinen nach dem westlichen Blotting von Ganzzellproteinlysaten bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Phosphoproteine zu erhalten, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.
Introduction
Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Bei der Maus beginnt dieser Prozess am embryonalen Tag (E) 9,5 mit der Bildung der frontonasalen Prominenz und Paaren von Oberkiefer- und Unterkieferprozessen, von denen jeder postmigratorische kraniale Neuralleistenzellen enthält. Die lateralen und medialen Nasenfortsätze entstehen aus der frontonasalen Prominenz mit dem Auftreten der Nasengruben und verschmelzen schließlich zu den Nasenlöchern. Darüber hinaus verschmelzen die medialen Nasenfortsätze und Oberkieferfortsätze zur Erzeugung der Oberlippe. Gleichzeitig wird die Palatogenese mit der Bildung von deutlichen Auswüchsen – den sekundären palatalen Regalen – von der oralen Seite der Oberkieferprozesse bei E11.5 eingeleitet. Im Laufe der Zeit wachsen die Gaumenböden auf beiden Seiten der Zunge nach unten, heben sich in eine entgegengesetzte Position über der Zunge und verschmelzen schließlich an der Mittellinie, um einen kontinuierlichen Gaumen zu bilden, der die Nasen- und Mundhöhle durch E16.51 trennt.
Diese morphologischen Veränderungen während der kraniofazialen Entwicklung werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Zum Beispiel werden Zellmembranrezeptoren, wie Unterfamilien von TGF)-β-Rezeptoren (transforming growth factor), einschließlich knochenmorphogenetischer Proteinrezeptoren (BMPRs), und verschiedener Rezeptortyrosinkinase (RTK) -Familien, bei Ligandenbindung und Aktivierung in kranialen Neuralleistenzellen autophosphoryliert 2,3,4 . Darüber hinaus wird der G-Protein-gekoppelte Transmembranrezeptor Smoothened in kranialen Neuralleistenzellen und kraniofazialen Ektoderm stromabwärts des Sonic Hedgehog (SHH) -Liganden, der an den Patched1-Rezeptor bindet, phosphoryliert, was zu einer geglätteten Akkumulation an der Ziliarmembran und SHH-Signalwegaktivierungführt 5. Solche Liganden-Rezeptor-Interaktionen können durch autokrine, parakrine und/oder juxtacrine Signalgebung in kraniofazialen Kontexten auftreten. Zum Beispiel ist bekannt, dass BMP6 während der Chondrozytendifferenzierung6 autokrin signalisiert, während der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) 8 im Rachenbogenektoderm exprimiert wird und an Mitglieder der FGF-Familie von RTKs bindet, die im Pharynxbogenmesenchym parakrin ausgedrückt werden, um die Strukturierung und das Auswachsen der Pharynxbögeneinzuleiten 7, 8,9,10 Darüber hinaus wird die Notch-Signalgebung sowohl in Chondrozyten als auch in Osteoblasten während der kraniofazialen Skelettentwicklung durch Juxtacrin-Signalisierung aktiviert, wenn Transmembran-Delta- und/oder Jagged-Liganden an Transmembran-Notch-Rezeptoren auf benachbarten Zellen binden, die anschließend gespalten und phosphoryliertwerden 11. Es gibt jedoch andere Liganden- und Rezeptorpaare, die für die kraniofaziale Entwicklung wichtig sind und die Flexibilität haben, sowohl bei der autokrinen als auch bei der parakrinen Signalgebung zu funktionieren. Als Beispiel wurde während der Morphogenese des murinen Zahns gezeigt, dass der von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF)-AA-Ligand autokrin signalisiert, den RTK PDGFRα im Schmelzorganepithel12 zu aktivieren. Im Gegensatz dazu werden bei murinen Gesichtsprozessen während der mittleren Schwangerschaft Transkripte, die für die Liganden PDGF-AA und PDGF-CC kodieren, im kraniofazialen Ektoderm exprimiert, während der PDGFRα-Rezeptor im zugrunde liegenden Schädelneuralkamm-abgeleiteten Mesenchym exprimiert wird, was zu einer parakrinen Signalgebung 13,14,15,16,17 führt. . Unabhängig vom Signalmechanismus führen diese Rezeptorphosphorylierungsereignisse häufig zur Rekrutierung von Adapterproteinen und/oder Signalmolekülen, die häufig selbst phosphoryliert werden, um intrazelluläre Kinasekaskaden wie den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) -Signalweg18,19 zu initiieren.
Die terminalen intrazellulären Effektoren dieser Kaskaden können dann eine Reihe von Substraten phosphorylieren, wie Transkriptionsfaktoren, RNA-bindende, zytoskelettale und extrazelluläre Matrixproteine. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 und Sox9 26 gehören zu den Transkriptionsfaktoren, die im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert werden. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) kann sich unter anderem direkt auf die Anfälligkeit für alternative PTMs, Dimerisierung, Stabilität, Spaltung und/oder DNA-bindende Affinität auswirken20,21,25,26. Zusätzlich wird das RNA-bindende Protein Srsf3 im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert, was zu seiner Kerntranslokation27 führt. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von RNA-bindenden Proteinen ihre subzelluläre Lokalisation, Protein-Protein-Interaktionen, RNA-Bindung und / oder Sequenzspezifität beeinflusst28. Darüber hinaus kann die Phosphorylierung von Actomyosin während der kraniofazialen Entwicklung zu zytoskelettalen Umlagerungen führen 29,30, und die Phosphorylierung extrazellulärer Matrixproteine, wie kleine integrinbindende Liganden-N-verknüpfte Glykoproteine, trägt zur Biomineralisierung während der Skelettentwicklungbei 31. Durch die oben genannten und zahlreiche andere Beispiele ist es offensichtlich, dass es weitreichende Implikationen für die Proteinphosphorylierung während der kraniofazialen Entwicklung gibt. Durch Hinzufügen einer zusätzlichen Regulierungsebene wird die Proteinphosphorylierung durch Phosphatasen weiter moduliert, die Kinasen entgegenwirken, indem sie Phosphatgruppen entfernen.
Diese Phosphorylierungsereignisse sowohl auf Rezeptor- als auch auf Effektormolekülebene sind entscheidend für die Ausbreitung von Signalwegen und führen letztendlich zu Veränderungen der Genexpression im Zellkern, die spezifische Zellaktivitäten wie Migration, Proliferation, Überleben und Differenzierung vorantreiben, die zu einer ordnungsgemäßen Bildung des Säugetiergesichts führen. Angesichts der Kontextspezifität von Proteininteraktionen mit Kinasen und Phosphatasen, der daraus resultierenden Veränderungen der PTMs und ihrer Auswirkungen auf die Zellaktivität ist es wichtig, dass diese Parameter in einem physiologisch relevanten Umfeld untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis des Beitrags von Phosphorylierungsereignissen zur kraniofazialen Entwicklung zu erhalten. Hier werden Beispiele für zwei Kontexte geliefert, in denen die Phosphorylierung von Proteinen und damit die Aktivierung von Signalwegen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren untersucht werden kann: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale palatale Mesenchymzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen – sowohl primär32 als auch immortalisiert33 . Bei E11.5 verschmelzen die Oberkieferfortsätze mit den lateralen und medialen Nasenfortsätzen1 und stellen damit einen kritischen Zeitpunkt während der kraniofazialen Entwicklung der Maus dar. Darüber hinaus wurden hier Oberkieferprozesse und Zellen aus den palatalen Regalen ausgewählt, da letztere Strukturen Derivate der ersteren sind, was den Forschern die Möglichkeit bietet, die Proteinphosphorylierung in vivo und in vitro in verwandten Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll gilt jedoch auch für alternative Gesichtsprozesse und Entwicklungszeitpunkte.
Ein kritisches Problem bei der Untersuchung phosphorylierter Proteine besteht darin, dass sie während der Proteinisolierung durch reichlich vorhandene Umweltphosphatasen leicht dephosphoryliert werden können. Um diese Barriere zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung phosphorylierter Proteine ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung phosphorylierter Proteine bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Signalwege zu gewinnen, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Forschern, kritische phosphorylierungsabhängige Signalereignisse während der kraniofazialen Entwicklung robust und reproduzierbar zu untersuchen. Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, die eine ordnungsgemäße Erfassung von Daten und die Analyse der Ergebnisse sicherstellen. Unabhängig davon, ob Phosphoproteine aus Gesichtsprozessen der Maus und/oder kultivierten palatalen Mesenchymzellen isoliert werden, ist es unerlässlich, sich schnell und effizi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
129S4-Mäuse waren ein Geschenk von Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine am Mount Sinai. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 und K02 DE028572 bis K.A.F., F31 DE029976 bis M.A.R. und F31 DE029364 bis B.J.C.D. unterstützt.
Materials
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca – 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
Referências
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