Voorbereiding van de heupzenuw van de rat voor ex vivo neurofysiologie
Summary
Dit protocol beschrijft de voorbereiding van het hele heupzenuwweefsel van ratten voor ex vivo elektrofysiologische stimulatie en registratie in een milieugereguleerd, tweecompartimenten, doordrenkt zoutoplossingsbad.
Abstract
Ex vivo preparaten maken de studie van vele neurofysiologische processen in isolatie van de rest van het lichaam mogelijk met behoud van de lokale weefselstructuur. Dit werk beschrijft de voorbereiding van heupzenuwen bij ratten voor ex vivo neurofysiologie, inclusief buffervoorbereiding, dierprocedures, apparatuuropstelling en neurofysiologische registratie. Dit werk geeft een overzicht van de verschillende soorten experimenten die mogelijk zijn met deze methode. De geschetste methode is gericht op het bieden van 6 uur stimulatie en registratie op geëxtraheerd perifeer zenuwweefsel in strak gecontroleerde omstandigheden voor optimale consistentie in resultaten. Resultaten verkregen met behulp van deze methode zijn A-fibre compound action potentials (CAP) met piek-tot-piek amplitudes in het millivolt bereik over de gehele duur van het experiment. CAP-amplitudes en -vormen zijn consistent en betrouwbaar, waardoor ze nuttig zijn om nieuwe elektroden te testen en te vergelijken met bestaande modellen, of de effecten van interventies op het weefsel, zoals het gebruik van chemicaliën, chirurgische veranderingen of neuromodulerende stimulatietechnieken. Zowel conventionele in de handel verkrijgbare manchetelektroden met platina-iridiumcontacten als op maat gemaakte geleidende elastomeerelektroden werden getest en gaven vergelijkbare resultaten in termen van zenuwstimulussterkte-duurrespons.
Introduction
Het huidige begrip van de fundamentele zenuwfunctie zoals gemodelleerd in silico ontbreekt in verschillende aspecten, met name met betrekking tot de effecten van zenuwweefselcompartimentalisatie buiten de soma, axon en dendrieten. Axon-myeline-interacties worden nog steeds slecht begrepen, zoals blijkt uit het feit dat zelfs gedetailleerde computationele zenuwmodellen zoals MRG1 (voor zoogdierzenuwen) die de conventionele elektrische stimulatierespons adequaat vastleggen, geen ander experimenteel waargenomen gedrag vastleggen, zoals hoogfrequent blokoverdracht2 of secundaire aanvangsrespons3.
Dit protocol biedt een methode om neurofysiologische processen op zenuwniveau efficiënt te onderzoeken in een acuut klein proefdiermodel, met behulp van een gestandaardiseerd voorbereidingsprotocol om de zenuw te isoleren, de omgeving te beheersen en deze uit een in vivo context naar een ex vivo context te verwijderen. Dit voorkomt andere lichaamsprocessen of anesthetica die worden gebruikt door in vivo zenuwstimulatieprotocollen om het zenuwgedrag te veranderen en de gemeten resultaten of hun interpretatie te verstoren 4,5. Dit maakt de ontwikkeling mogelijk van meer realistische modellen die zich uitsluitend richten op effecten die specifiek zijn voor zenuwweefsels die slecht worden begrepen. Dit protocol is ook nuttig als testbed voor nieuwe zenuwstimulatie en opname-elektrodematerialen en geometrieën, evenals nieuwe stimulatieparadigma’s zoals hoogfrequent blok 2,3. Variaties van deze techniek zijn eerder gebruikt om de zenuwfysiologie te bestuderen in strak gecontroleerde omstandigheden6, bijvoorbeeld om de dynamiek en eigenschappen van ionkanalen of de effecten van lokale anesthetica te meten7.
Deze techniek biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieven zoals acute in vivo experimenten met kleine dieren8. De techniek voorkomt de noodzaak om de anesthesiediepte te behouden, omdat het weefsel uit het lichaam is geëxtraheerd, waardoor de hoeveelheid benodigde apparatuur zoals een verdovingsverspreider, zuurstofconcentrator en verwarmingspad wordt verminderd. Dit vereenvoudigt het experimentele protocol, waardoor het risico op fouten wordt verkleind. Omdat anesthetica mogelijk de zenuwfunctie kunnen veranderen4, zorgt deze techniek ervoor dat maatregelen niet worden verstoord door bijwerkingen van deze anesthetische verbindingen. Ten slotte is deze techniek geschikter dan acute in vivo experimenten bij het bestuderen van de effecten van neurotoxische verbindingen zoals tetrodotoxine, die een verdoofd dier door verlamming zouden doden.
Perifere zenuwsecties zijn een uniek ex vivo systeem omdat er een grote kans is dat de vezels die verantwoordelijk zijn voor geregistreerde neurale signalen geen soma bevatten. Omdat deze zich normaal gesproken zouden bevinden, kan voor motorneuronen in de wervelkolom en voor sensorische neuronen in de dorsale wortelganglia naast de wervelkolom, de voorbereiding van een deel van de zoogdierzenuw ruwweg worden gemodelleerd als een verzameling buisvormige membranen met ionkanalen, open aan beide uiteinden9. Het metabolisme wordt in stand gehouden door de mitochondriën in het axon op het moment van weefseldissectie10. Het hechten van de open uiteinden van het axolemma wordt na extractie aangemoedigd om ze te sluiten en daardoor bestaande ionische gradiënten over het membraan te behouden, die essentieel zijn voor de normale zenuwfunctie.
Om weefselhomeostase buiten het lichaam te behouden, moeten verschillende omgevingsvariabelen strak worden gecontroleerd. Dit zijn temperatuur11, oxygenatie12, osmolariteit, pH13,14 en toegang tot glucose om het metabolisme te behouden. Voor dit protocol is de aanpak om een gemodificeerde Krebs-Henseleit buffer15,16 (mKHB) te gebruiken die continu wordt belucht met een mengsel van zuurstof en koolstofdioxide. De mKHB behoort tot de familie van cardioplege buffers 6,17 die worden gebruikt om ontleed weefsel buiten het lichaam te bewaren, bijvoorbeeld in ex vivo experimenten. Deze buffers bevatten geen hemoglobine, antibiotica of antischimmelmiddelen en zijn daarom alleen geschikt voor preparaten waarbij gedurende een beperkte tijd kleine hoeveelheden weefsel betrokken zijn. pH-controle werd bereikt met het carbonaat- en koolstofdioxide-redoxpaar, waardoor constante beluchting van de buffer met koolstofdioxide nodig was om het pH-evenwicht te behouden. Dit is om het gebruik van andere veel voorkomende buffermiddelen zoals HEPES te vermijden, die de zenuwcelfunctie kunnen wijzigen18. Om de buffer van zuurstof te voorzien en de pH-regeling te regelen, werd een mengsel van 5% koolstofdioxide in zuurstof genaamd carbogen (95% O2, 5% CO2) gebruikt. Een verwarmingsroerder werd gebruikt voor temperatuurregeling van een buffercontainer en de buffer werd door een zenuwbad gedrenkt en vervolgens gerecirculeerd naar de startcontainer. Een typisch experiment zou 6-8 uur duren voordat de zenuw zijn levensvatbaarheid verliest en niet langer voldoende reageert op stimulatie om maatregelen representatief te maken voor gezond weefsel.
Om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren, werden zilverchloride-elektroden gebruikt voor opname, die werden bereid volgens eerder beschreven methoden19. Voor stimulatie kan een combinatie van commerciële kant-en-klare platina manchetelektroden en op maat gemaakte geleidende polymeermanchetelektroden worden gebruikt. Geleidende polymeermanchetelektroden hebben aanzienlijk hogere laadcapaciteiten, die nuttig zijn bij het stimuleren van de zenuw met behulp van golfvormen met hoge amplitude20.
De stimulator die in dit protocol wordt gebruikt, is eerder beschreven20. Documentatie, ontwerpbestanden en softwarescripts om het te gebruiken zijn openbaar beschikbaar21. Andere stimulatoren kunnen worden gebruikt om dit protocol uit te voeren; de aangepaste stimulator is echter ook in staat tot hoogfrequente alternatieve stroom (HFAC) blok 2,20, wat een breder scala aan neurofysiologische experimenten mogelijk maakt. Om HFAC-blok te gebruiken, worden geleidende elastomeermanchetten aanbevolen om schade aan de zenuw te voorkomen. Geleidende elastomeerzenuwmanchetten zijn zachte en volledig polymere elektrode-arrays geproduceerd uit geleidende elastomeren als geleidende component en polydimethylsiloxaan als isolatie22. Apparaten werden vervaardigd in een bipolaire configuratie met behulp van conventionele lasermicrofabricagetechnieken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk beschreven we een protocol om heupzenuwen van ratten voor te bereiden op ex vivo neurofysiologie. Weefselextractie duurt ongeveer 30 minuten, inclusief het hanteren van dieren, anesthesie, ruimen en dissectie, terwijl zenuwreiniging, plaatsing in het bad en elektrode-implantatie nog eens 30 minuten nodig hebben voordat de opname kan worden gestart. Buffervoorbereiding kan in 30 minuten worden uitgevoerd, hoewel dit vóór de rest van het experiment kan worden gedaan. Dit type voorbereiding en experim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Dr. Gerald Hunsberger van GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA en Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) voor het delen van hun originele zenuwvoorbereidingstechniek met ons. De auteurs erkennen Robert Toth voor het ontwerp van het dubbelkamerzenzenbad. De auteurs erkennen financiering van de Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) subsidie van de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). De auteurs erkennen het High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) van Imperial College London voor de financiering van Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux wordt momenteel gefinancierd door het UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. De auteurs bedanken Zack Bailey van Imperial College, in het Department of Bioengineering, voor hulp bij experimenten en toegang tot dierlijke weefsels tijdens de productie van het JoVE-videoartikel.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
Referências
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
