Ex Vivo 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 제조
Summary
이 프로토콜은 생체외 전기생리학적 자극을 위한 래트 전체 좌골 신경 조직의 제조를 기술하고, 환경적으로 조절된, 두 구획, 관류 식염수 욕조에서 기록한다.
Abstract
생체외 제제는 국소 조직 구조를 보존하면서 신체의 나머지 부분으로부터 격리된 많은 신경생리학적 과정의 연구를 가능하게 한다. 이 연구는 버퍼 준비, 동물 절차, 장비 설정 및 신경 생리 학적 기록을 포함하여 생체 외 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 준비를 설명합니다. 이 작업은이 방법으로 가능한 다양한 유형의 실험에 대한 개요를 제공합니다. 개요 된 방법은 결과의 최적 일관성을 위해 엄격하게 통제 된 조건에서 추출 된 말초 신경 조직에 6 시간의 자극 및 기록을 제공하는 것을 목표로합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 결과는 실험의 전체 기간 동안 밀리볼트 범위의 피크 대 피크 진폭을 갖는 A-파이버 화합물 작용 전위(CAP)입니다. CAP 진폭과 모양은 일관되고 신뢰할 수 있으므로 새로운 전극을 기존 모델 또는 화학 물질의 사용, 외과 적 변경 또는 신경 조절 자극 기술의 사용과 같은 조직에 대한 개입의 영향을 테스트하고 비교하는 데 유용합니다. 백금-이리듐 접촉부를 갖는 기존의 상업적으로 이용가능한 커프 전극과 맞춤형 전도성 엘라스토머 전극 둘 다를 시험하였고, 신경 자극 강도-지속시간 반응의 관점에서 유사한 결과를 제공하였다.
Introduction
실리코에서 모델링된 바와 같은 근본적인 신경 기능에 대한 현재의 이해는 여러 측면에서, 특히 소마, 축삭돌기 및 덴드라이트의 외부 신경 조직 구획화의 효과와 관련하여 결여되어 있다. 축삭-미엘린 상호작용은 종래의 전기 자극 반응을 적절히 포착하는 MRG1(포유동물 신경에 대한)과 같은 상세한 계산 신경 모델조차도, 고주파 블록 이월오버2 또는 2차 발병 반응3과 같은 다른 실험적으로 관찰된 거동을 포착하지 못한다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 여전히 잘 이해되지 않는다.
이 프로토콜은 표준화된 준비 프로토콜을 사용하여 신경을 분리하고, 그 환경을 제어하고, 생체내 맥락에서 생체외 맥락으로 이를 제거하기 위해 표준화된 준비 프로토콜을 사용하여 급성 소형 실험실 동물 모델에서 신경 수준에서 신경 생리학적 과정을 효율적으로 조사하는 방법을 제공한다. 이것은 신경 거동을 변경하고 측정 결과 또는 그들의 해석 4,5을 혼란스럽게하기 위해 생체 내 신경 자극 프로토콜에 의해 사용되는 다른 신체 과정 또는 마취제를 방지 할 것이다. 이를 통해 제대로 이해되지 않는 신경 조직에 특유한 효과에만 초점을 맞추는보다 현실적인 모델을 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 새로운 신경 자극 및 기록 전극 재료 및 기하학뿐만 아니라 고주파 블록 2,3과 같은 새로운 자극 패러다임을 위한 테스트베드로도 유용하다. 이 기술의 변형은 이전에 엄격하게 조절된 조건6에서 신경 생리학을 연구하기 위해, 예를 들어, 이온 채널 역학 및 특성 또는 국소 마취제의 효과를 측정하기 위해 사용되었다7.
이 기술은 급성 생체내 작은 동물 실험(8)과 같은 대안에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 이 기술은 조직이 신체에서 추출됨에 따라 마취 깊이를 유지할 필요성을 없애고 마취 산광기, 산소 농축기 및 가열 패드와 같은 필요한 장비의 양을 줄입니다. 이를 통해 실험 프로토콜이 단순화되어 실수 위험이 줄어듭니다. 마취제가 잠재적으로 신경 기능4을 변화시킬 수 있기 때문에, 이 기술은 이러한 마취 화합물의 부작용에 의해 측정이 혼동되지 않도록 보장한다. 마지막으로,이 기술은 마비에 의해 마취 된 동물을 죽일 수있는 테트로도톡신과 같은 신경 독성 화합물의 효과를 연구 할 때 급성 생체 내 실험보다 더 적절합니다.
말초 신경 절편은 기록된 신경 신호를 담당하는 섬유가 어떠한 소마도 포함하지 않을 가능성이 높기 때문에 독특한 생체외 시스템이다. 이들은 일반적으로 운동 뉴런, 척추 및 척추 옆의 등쪽 뿌리 신경절의 감각 뉴런에 위치하기 때문에 포유류 신경의 한 부분의 준비는 양쪽 끝에서 열린 이온 채널이있는 관형 막의 집합체로 대략적으로 모델링 될 수 있습니다9. 신진대사는 조직 해부(10)시에 축삭돌기에 위치한 미토콘드리아에 의해 유지된다. axolemma의 열린 끝의 봉합은 추출 후 그들을 닫는 것이 권장되므로 정상적인 신경 기능에 필수적인 멤브레인 전체에 걸쳐 기존의 이온 구배를 유지하는 데 도움이됩니다.
신체 외부의 조직 항상성을 유지하려면 몇 가지 환경 변수를 엄격하게 통제해야합니다. 이들은 온도 11, 산소화12, 삼투압, pH13,14 및 신진 대사를 유지하기 위해 포도당에 대한 접근입니다. 이 프로토콜을 위해, 접근법은 산소와 이산화탄소의 혼합물로 연속적으로 폭기된 변형된 크렙스-헨셀릿 완충액15,16(mKHB)을 사용하는 것이다. mKHB는 예를 들어 생체외 실험에서 신체 외부의 해부된 조직을 보존하는데 사용되는 심흉막 완충액(6,17)의 패밀리에 있다. 이러한 완충제는 헤모글로빈, 항생제 또는 항진균제를 함유하지 않으며, 따라서 제한된 시간 동안 소량의 조직을 포함하는 제제에만 적합하다. pH 조절은 탄산염과 이산화탄소 산화 환원 쌍으로 달성되었으며, pH 평형을 유지하기 위해 이산화탄소로 완충액의 일정한 폭기가 필요했습니다. 이는 신경 세포 기능(18)을 변형시킬 수 있는 HEPES와 같은 다른 일반적인 완충제를 사용하는 것을 피하기 위함이다. 완충제를 산소화하고 pH 조절을 제공하기 위해, 카르보겐(95% O2, 5%CO2)이라고 불리는 산소 중의 5% 이산화탄소의 혼합물이 사용되었다. 완충 용기의 온도 조절을 위해 가열 교반기를 사용하고, 버퍼를 신경 배쓰를 통해 관류시킨 다음, 출발 용기로 재순환시켰다. 전형적인 실험은 신경이 생존력을 잃고 더 이상 건강한 조직을 대표하기위한 자극에 충분히 반응하지 않기 전에 6-8 시간 동안 지속됩니다.
신호-대-잡음비를 최적화하기 위해, 은-염화물 전극이 기록에 사용되었고, 이는 앞서 설명된 방법19에 따라 제조되었다. 자극을 위해, 상용 기성품 백금 커프 전극과 맞춤형 전도성 폴리머 커프 전극의 조합이 사용될 수 있다. 전도성 폴리머 커프 전극은 현저하게 더 높은 전하 용량을 가지며, 이는 높은 진폭 파형(20)을 사용하여 신경을 자극할 때 유용하다.
이 프로토콜에 사용된 자극기는 앞서 설명되었다(20). 이를 사용할 문서, 설계 파일 및 소프트웨어 스크립트는 공개적으로 입수가능하다(21). 이 프로토콜을 실행하기 위해 다른 자극기를 사용할 수 있습니다. 그러나 맞춤형 자극기는 고주파 대체 전류 (HFAC) 블록2,20을 사용할 수있어 더 넓은 범위의 신경 생리학 실험을 가능하게합니다. HFAC 블록을 사용하려면 신경 손상을 피하기 위해 전도성 엘라스토머 커프스를 사용하는 것이 좋습니다. 전도성 엘라스토머 신경 커프는 전도성 성분으로서 전도성 엘라스토머로부터 생산되고 절연체로서 폴리디메틸실록산(22)으로서 부드럽고 완전 폴리머 전극 어레이이다. 장치는 종래의 레이저 미세제조 기술을 사용하여 양극성 구성으로 제조되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서, 우리는 생체외 신경 생리학을 위해 쥐 좌골 신경을 준비하기위한 프로토콜을 기술했다. 조직 추출은 동물 취급, 마취, 도태 및 해부를 포함하여 약 30 분이 소요되며, 신경 청소, 욕조 배치 및 전극 이식은 녹음을 시작하기 전에 추가 30 분이 필요합니다. 완충액 준비는 30 분 안에 수행 할 수 있지만 나머지 실험보다 앞서 수행 할 수 있습니다. 이러한 유형의 준비 및 실험은 과거<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 GlaxoSmithKline Pharmaceuticals의 Gerald Hunsberger 박사, King of Prussia, PA, USA, Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK)가 원래의 신경 준비 기술을 우리와 공유했음을 인정합니다. 저자들은 Robert Toth가 Dual-Chamber 신경 목욕 디자인을 인정했습니다. 저자들은 EPSRC (Engineering and Physical Sciences Research Council)의 HTCA(Healthcare Technologies Challenge Awards) 보조금의 자금을 인정합니다. 저자들은 Adrien Rapeaux (EP / L016796 / 1)에 자금을 지원하기 위해 Imperial College London의 고성능 임베디드 및 분산 시스템 센터 (HiPEDS CDT)를 인정합니다. Adrien Rapeaux는 현재 영국 치매 연구소, 케어 연구 및 기술 센터에서 자금을 지원하고 있습니다. 저자들은 JoVE 비디오 기사를 제작하는 동안 실험과 동물 조직에 대한 접근에 대한 도움을 얻기 위해 생명 공학과에있는 임페리얼 칼리지의 잭 베일리 (Zack Bailey)를 감사하게 인정합니다.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
Referências
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