Preparación del nervio ciático de rata para neurofisiología ex vivo
Summary
Este protocolo describe la preparación de tejido nervioso ciático entero de rata para la estimulación electrofisiológica ex vivo y el registro en un baño salino perfundido de dos compartimentos, regulado ambientalmente.
Abstract
Las preparaciones ex vivo permiten el estudio de muchos procesos neurofisiológicos de forma aislada del resto del cuerpo, preservando al mismo tiempo la estructura del tejido local. Este trabajo describe la preparación de los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo, incluida la preparación tampón, los procedimientos en animales, la configuración del equipo y el registro neurofisiológico. Este trabajo proporciona una visión general de los diferentes tipos de experimentos posibles con este método. El método descrito tiene como objetivo proporcionar 6 h de estimulación y registro en el tejido nervioso periférico extraído en condiciones estrechamente controladas para una consistencia óptima en los resultados. Los resultados obtenidos utilizando este método son potenciales de acción compuestos de fibra A (CAP) con amplitudes de pico a pico en el rango de milivoltios durante toda la duración del experimento. Las amplitudes y formas de CAP son consistentes y confiables, lo que las hace útiles para probar y comparar nuevos electrodos con modelos existentes, o los efectos de las intervenciones en el tejido, como el uso de productos químicos, alteraciones quirúrgicas o técnicas de estimulación neuromoduladora. Se probaron tanto electrodos de manguito convencionales disponibles comercialmente con contactos de platino-iridio como electrodos de elastómero conductor hechos a medida y dieron resultados similares en términos de respuesta de fuerza-duración del estímulo nervioso.
Introduction
La comprensión actual de la función nerviosa fundamental según lo modelado in silico carece de varios aspectos, especialmente con respecto a los efectos de la compartimentación del tejido nervioso fuera del soma, el axón y las dendritas. Las interacciones axon-mielina todavía son poco conocidas, como lo demuestra el hecho de que incluso los modelos nerviosos computacionales detallados como MRG1 (para nervios de mamíferos) que capturan adecuadamente la respuesta de estimulación eléctrica convencional, no capturan otros comportamientos observados experimentalmente, como el arrastre de bloque de alta frecuencia2 o la respuesta de inicio secundario3.
Este protocolo proporciona un método para investigar eficientemente los procesos neurofisiológicos a nivel nervioso en un modelo animal de laboratorio pequeño agudo, utilizando un protocolo de preparación estandarizado para aislar el nervio, controlar su entorno y eliminarlo de un contexto in vivo a un contexto ex vivo. Esto evitará otros procesos corporales o anestésicos utilizados por los protocolos de estimulación nerviosa in vivo para alterar el comportamiento nervioso y confundir los resultados medidos o su interpretación 4,5. Esto permite el desarrollo de modelos más realistas que se centran únicamente en los efectos específicos de los tejidos nerviosos que son poco conocidos. Este protocolo también es útil como banco de pruebas para la nueva estimulación nerviosa y el registro de materiales y geometrías de electrodos, así como nuevos paradigmas de estimulación como el bloque de alta frecuencia 2,3. Las variaciones de esta técnica se han utilizado previamente para estudiar la fisiología nerviosa en condiciones estrictamente controladas6, por ejemplo, para medir la dinámica y las propiedades de los canales iónicos o los efectos de los anestésicos locales7.
Esta técnica aporta varias ventajas frente a alternativas como la experimentación aguda in vivo con pequeños animales8. La técnica evita la necesidad de mantener la profundidad de la anestesia a medida que el tejido se ha extraído del cuerpo, reduciendo la cantidad de equipo requerido, como un difusor anestésico, un concentrador de oxígeno y una almohadilla térmica. Esto simplifica el protocolo experimental, reduciendo el riesgo de errores. Como los anestésicos pueden alterar potencialmente la función nerviosa4, esta técnica garantiza que las medidas no se vean confundidas por los efectos secundarios de estos compuestos anestésicos. Finalmente, esta técnica es más apropiada que los experimentos agudos in vivo a la hora de estudiar los efectos de compuestos neurotóxicos como la tetrodotoxina, que mataría a un animal anestesiado por parálisis.
Las secciones nerviosas periféricas son un sistema ex vivo único, ya que existe una alta probabilidad de que las fibras responsables de las señales neuronales registradas no contengan ningún soma. Como estos normalmente se ubicarían, para las neuronas motoras, en la columna vertebral y para las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal junto a la columna vertebral, la preparación de una sección del nervio de los mamíferos se puede modelar aproximadamente como una colección de membranas tubulares con canales iónicos, abiertos en ambos extremos9. El metabolismo es mantenido por las mitocondrias localizadas en el axón en el momento de la disección tisular10. Se recomienda la sutura de los extremos abiertos del axolemma después de la extracción para cerrarlos y, por lo tanto, ayudar a mantener los gradientes iónicos existentes a través de la membrana, que son esenciales para la función nerviosa normal.
Para mantener la homeostasis tisular fuera del cuerpo, varias variables ambientales deben ser estrictamente controladas. Estos son la temperatura11, la oxigenación12, la osmolaridad, el pH13,14 y el acceso a la glucosa para mantener el metabolismo. Para este protocolo, el enfoque es utilizar un tampón Krebs-Henseleitmodificado 15,16 (mKHB) continuamente aireado con una mezcla de oxígeno y dióxido de carbono. El mKHB pertenece a la familia de tampones cardiopléjicos 6,17 utilizados para preservar tejidos disecados fuera del cuerpo, por ejemplo, en experimentos ex vivo. Estos tampones no contienen hemoglobina, antibióticos o antifúngicos y, por lo tanto, solo son adecuados para preparaciones que involucran pequeñas cantidades de tejido durante un tiempo limitado. El control del pH se logró con el par redox de carbonato y dióxido de carbono, requiriendo una aireación constante del tampón con dióxido de carbono para mantener el equilibrio del pH. Esto es para evitar el uso de otros agentes amortiguadores comunes como HEPES, que puede modificar la función de las células nerviosas18. Para oxigenar el tampón y proporcionar control del pH, se utilizó una mezcla de 5% de dióxido de carbono en oxígeno llamada carbógeno (95% O2, 5% CO2). Se utilizó un agitador de calentamiento para el control de la temperatura de un recipiente tampón, y el tampón se perfundió a través de un baño nervioso y luego se recirculó al recipiente inicial. Un experimento típico duraría 6-8 h antes de que el nervio pierda su viabilidad y ya no responda lo suficiente a la estimulación para que las medidas sean representativas del tejido sano.
Para optimizar la relación señal-ruido, se utilizaron electrodos de cloruro de plata para la grabación, que se prepararon de acuerdo con los métodos descritos anteriormente19. Para la estimulación, se puede utilizar una combinación de electrodos de manguito de platino comerciales listos para usar y electrodos de manguito de polímero conductor hechos a medida. Los electrodos conductores de manguito de polímero tienen capacidades de carga notablemente más altas, que son útiles cuando se estimula el nervio utilizando formas de onda de alta amplitud20.
El estimulador utilizado en este protocolo ha sido descrito previamente20. La documentación, los archivos de diseño y los scripts de software para usarlo están disponibles públicamente21. Se pueden utilizar otros estimuladores para ejecutar este protocolo; sin embargo, el estimulador personalizado también es capaz de bloquearel bloque 2,20 de corriente alternativa de alta frecuencia (HFAC), lo que permite una gama más amplia de experimentos de neurofisiología. Para usar el bloque HFAC, se recomiendan manguitos de elastómero conductor para evitar daños en el nervio. Los manguitos nerviosos de elastómero conductor son matrices de electrodos blandos y totalmente poliméricos producidos a partir de elastómeros conductores como componente conductor y polidimetilsiloxano como aislamiento22. Los dispositivos se fabricaron en una configuración bipolar utilizando técnicas convencionales de microfabricación láser.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, describimos un protocolo para preparar los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo. La extracción de tejidos toma aproximadamente 30 minutos, incluida la manipulación de animales, la anestesia, el sacrificio y la disección, mientras que la limpieza de los nervios, la colocación en el baño y la implantación de electrodos deben requerir 30 minutos adicionales antes de que se pueda iniciar el registro. La preparación del búfer se puede llevar a cabo en 30 minutos, aunque …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen al Dr. Gerald Hunsberger de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, EE.UU., y Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartir su técnica original de preparación nerviosa con nosotros. Los autores reconocen a Robert Toth por el diseño del baño nervioso de doble cámara. Los autores reconocen la financiación de la subvención Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC). Los autores reconocen al High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) del Imperial College de Londres por financiar a Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux está financiado actualmente por el Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido, Centro de Investigación y Tecnología de la Atención. Los autores agradecen a Zack Bailey del Imperial College, en el Departamento de Bioingeniería, por su ayuda con los experimentos y el acceso a los tejidos animales durante la producción del artículo de video de JoVE.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
Referências
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
