Poliep bail-out is een proces dat wordt veroorzaakt door acute stress, waarbij koraalpoliepen het weefsel verteren dat hen verbindt met hun kolonie en zich ervan losmaken om als individuen te leven. Het huidige protocol beschrijft hoe koraalmicropropagatie kan worden geïnduceerd door bail-out met behulp van hypersaline of calciumvrije zeewaterbehandelingen.
Koralen zijn koloniale dieren gevormd door modulaire eenheden die poliepen worden genoemd. Koraalpoliepen zijn fysiologisch verbonden en verbonden door weefsel. Het fenomeen van poliep bail-out is een proces dat wordt veroorzaakt door acute stress, waarbij koraalpoliepen het weefsel verteren dat hen verbindt met de rest van de kolonie en uiteindelijk loskomen van het skelet om als afzonderlijke individuen te blijven leven. Koraalbiologen erkennen al jaren het proces van poliep bail-out, maar pas onlangs zijn de micropropagates die door dit proces worden gegenereerd erkend als een modelsysteem voor koraalbiologische studies. Het gebruik van poliep bail-out kan een groot aantal klonale eenheden creëren uit een enkel koraalfragment. Een ander voordeel is dat enkele poliepen of poliepenpleisters gemakkelijk onder een microscoop kunnen worden gevisualiseerd en onderhouden in sterk gestandaardiseerde goedkope omgevingen zoals petrischalen, kolven en microfluïdische chips. Het huidige protocol demonstreert reproduceerbare methoden die in staat zijn om koraalmicropropagatie te induceren en verschillende benaderingen voor het in leven houden van de enkele poliepen op de lange termijn. Deze methodologie was in staat om met succes poliepen van de koraalsoort Pocillopora verrucosa te cultiveren tot 8 weken na de bail-out, waarbij de bruikbaarheid van het gebruik van individuele koraalpoliepen voor koraalonderzoek werd aangetoond.
Scleractinische of rifbouwende koralen zijn cnidarians die in staat zijn om carbonaatskeletten te vormen, riffen te creëren en structureel complexe ecosystemen die te vinden zijn van diepe tot ondiepe wateromgevingen1. Tropische koraalriffen herbergen een hoge biodiversiteit en bieden essentiële ecosysteemdiensten, zoals kustbescherming en visserijonderhoud2. De meeste ondiepwaterrifbouwende koralen vertrouwen op een mutualistische relatie met algen van de familie Symbiodiniaceae, die de energie leveren die koralen nodig hebben om hun skeletten te bouwen. De symbiose tussen het koraal en de algen kan worden verbroken door omgevingsstress, waardoor koraal 3,4,5,6 wordt gebleekt. Recente temperatuuranomalieën hebben grote koraalverblekingsgebeurtenissen over de hele wereld veroorzaakt, wat leidt tot massale koraalsterfte en permanente rifdegradatie 7,8,9,10,11. Omdat dit fenomeen is gebaseerd op de uitdrijving van symbionten door post-hittestress-geassocieerde cellulaire mechanismen, zoals apoptose, autofagie en exocytose, kan koraalverbleking worden beschreven als een cellulair proces dat gevolgen op ecosysteemschaal heeft 5,6,12, wat betekent dat het hebben van in vitro culturen van koraalcellen of weefsels van toepassing zou zijn om dit fenomeen van dichtbij te bestuderen.
Vanwege het belang van koraalriffen en de grote bedreigingen waarmee ze zijn geconfronteerd, met name in de afgelopen twee decennia2, zijn koralen wereldwijd de focus geworden van onderzoek voor beschermings- en restauratiedoeleinden13. De ontwikkeling van benaderingen en experimentele systemen die betrouwbaar en reproduceerbaar zijn en een minimale impact op het milieu bieden om koralen te bestuderen, is echter een grote strijd op dit gebied.
Micropropagatie wordt gedefinieerd als de in vitro proliferatie van het genotype van een organisme door het kweken van zijn biologisch materiaal in gecontroleerde vaten14,15. Het kweken van cellen, weefsels en organen is de afgelopen decennia cruciaal geweest voor de biologie van planten en dieren. Het maakt de massale reproductie van organismen in laboratoria, de snelle beoordeling van verschillende behandelingen (zoals geneesmiddelen en geneesmiddelen) en de directe studie van celfunctie 14,15,16,17 mogelijk. Over het algemeen zijn in vitro modellen nuttig geweest voor het aanvullen en verdiepen van de studies van verschillende organismen onder beter gecontroleerde fysische en chemische omstandigheden. Vanwege de voordelen van in vitro kweektechnieken zijn verschillende dierlijke cel- en weefselkweektechnologieën ontwikkeld, geoptimaliseerd en gebruikt als belangrijke hulpmiddelen in veel onderzoeksgebieden, waar meerdere cellijnen zijn bestudeerd en gecommercialiseerd voor tal van toepassingen 16,17,18.
Veel vooruitgang in de kennis van cel- en weefselkweek is geboekt sinds de eerste dierlijke weefselkweek in 188217, zoals het gebruik van natuurlijke en synthetische media, de uitvinding van gevestigde cellijnen en de ontwikkeling van 3D-media om een veelheid aan celtypen op een betere manier te cultiveren 16,17, 18,19. Het gebied van celbiologie heeft zich echter vooral gericht op een selecte groep modelorganismen, terwijl veel taxa nog steeds geen gevestigde in vitro culturen van cellen, weefsels of organen hebben20. In koraalonderzoek zijn bijvoorbeeld geen onsterfelijke cellijnen op grote schaal gebruikt voor onderzoek, waardoor koraalcelonderzoek wordt beperkt tot het gebruik van primaire celculturen. Deze culturen hebben een levensvatbaarheid die beperkt is tot een paar weken21, zonder studies die de overleving van individuele cellen uit alle koraalweefsels gedurende meer dan 13 dagen tot begin 2021 registreren22. Het eerste rapport van duurzame koraalcellijnen dat werd gepubliceerd, was met Acropora tenuis-cellen die tot 6 maanden leefden, en het nut van deze cellen voor toekomstig onderzoek moet nog worden onderzocht23.
Om de beperkingen in het kweken van koraalcelculturen te overwinnen en een laboratoriumcultuur te behouden die de algehele weefselorganisatie van koralen behoudt, is het gebruik van geïsoleerde poliepen onlangs voorgesteld als een model voor koraalbiologisch onderzoek24,25. Poliepen zijn de anatomische eenheden van koralen, en elk van hen heeft een mond in het midden van hun orale schijf en is verbonden met andere poliepen door de coenosarc in zijn aboriale gebied26. De scheiding van levende poliepen vindt van nature plaats door het proces van poliep bail-out, waarbij acute stress de vertering van de coenosarc tussen de poliepen veroorzaakt, die vervolgens kan loskomen van het skelet van de kolonie 25,27,28. Dit fenomeen is gemeld om voor te komen in een verscheidenheid van taxa, waaronder octocoralen 29,30,31, zwarte koralen 32, en scleractinian koralen 25,27,28,32,33, en is in verband gebracht met meerdere omgevingsstressoren, zoals gebrek aan calcium in water24,34, verhoogde zuurgraad35, hyperosmotische omstandigheden 25,27,32,36, hoge temperaturen36,37, honger33, blootstelling aan lucht25,30 en insecticide besmetting28,38. Poliep bail-out is bijvoorbeeld gemeld in pocilloporide koralen19, die wijd verspreid zijn over de hele wereld en vaak worden gebruikt als modellen in koraalonderzoek. Soorten die tot deze groep behoren, zoals Pocillopora damicornis pt Styllophora pistillata, hebben ongeveer 30-40 micropropagates gegenereerd uit een fragment van 5 mm25. Dit aantal benadrukt het voordeel van het gebruik van poliep bail-out als een methode voor koraalmicropropagatie, omdat het de mogelijkheid creëert om veel genetisch identieke individuen te genereren uit een klein stukje koraal. Het gebruik van geïsoleerde poliepen voor onderzoek heeft ook dezelfde voordelen als celculturen met betrekking tot de mogelijkheid om te worden gekweekt in gecontroleerde laboratoriumomgevingen, zoals kolven en petrischalen. Bovendien hebben microfluïdische platforms om levende poliepen te onderhouden aangetoond dat deze micropropagates kunnen worden bewaard in relatief goedkope en gemakkelijk te reproduceren omgevingen, met gecontroleerde waterstroom, oppervlak en temperatuur24,25. Deze microfluïdica platforms kunnen ook worden gebruikt om levende koraalstructuren onder een microscoop direct24,25 te visualiseren.
In dit artikel vatten we de technieken samen die zijn ontwikkeld om individuele koraalpoliepen uit hun kolonies te isoleren en laten we zien hoe ze in laboratoriumomstandigheden kunnen worden onderhouden voor langdurige cultuur. De besproken methoden omvatten poliep bail-out door hyperosmotische omstandigheden door verdamping en het pompen van zeewater met een hoog zoutgehalte en incubatie in calciumvrij zeewater.
De overlevingskans van poliepen na te zijn onderworpen aan bail-outprocessen en de tijd die nodig is om het proces te voltooien, variëren tussen eerder gerapporteerd onderzoek 25,33,41, wat mogelijk wordt verklaard door de verschillende experimentele benaderingen die in elke studie worden toegepast. Verschillende koraalsoorten, of zelfs koralen van dezelfde soort, maar gewend aan verschillende omgevingsomstandigheden (bijv. Koralen uit de Rode Zee), presenteren verschillende drempels voor zoutgehalteniveaus. De gekozen methode van bail-out en de laboratorium/aquariumcondities spelen ook een belangrijke rol in de resultaten. In sommige gevallen heeft het onderhoud van koraalmicropropagates onder laboratoriumomstandigheden de overlevingstijd van koraalcelculturen overschreden door maanden van overleving te bereiken in azoöxanthellaat3 3,41 en zooxanthellaat25 koralen. De tijd voor het voltooien van het poliep-bail-outproces varieerde ook in verschillende onderzoeken, variërend van een paar uur2 5,2 7,30 tot week35 incubatie blootgesteld aan de stressor die verantwoordelijk is voor het veroorzaken van bail-out. Een andere variabele waarmee rekening moet worden gehouden bij het bestuderen van de bail-out van poliepen is het herstel van de poliepen na blootstelling aan de acute stress die hun vrijlating veroorzaakte. Het is nog steeds de vraag of poliepen na bail-out in een goede staat zijn om te worden gebruikt als modellen om koraalbiologie te bestuderen. Het herstel van hun weefsels na de afbraak van de coenosarc is een punt van zorg bij het gebruik van deze micropropagates. Poliepen in veel studies, waaronder de huidige, zijn echter in staat geweest om zooxanthellae-cellen in hun weefsels en externe morfologieën te presenteren met intacte oraal-abanale polarisatie en tentakels weken na bail-out 25,27,32,36. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat, na te zijn verlost van acute stress, vrijgekomen koraalpoliepen blootgesteld aan zeer zout of verwarmd zeewater in staat zijn geweest om de expressie van genen gerelateerd aan processen zoals apoptose, proteolyse en celdeling te herstellen tot niveaus die vergelijkbaar zijn met die gevonden vóór bail-out32,36 en zelfs om de expressie van genen gerelateerd aan weefselgenezing te verhogen36.
Met betrekking tot het verschil in overleving tussen methoden, is het belangrijk om te benadrukken dat deze tijd kan variëren tussen verschillende experimenten, zelfs als dezelfde technieken worden gebruikt, en het kan verband houden met de gezondheid van de gebruikte fragmenten en het juiste onderhoud van de poliepen na het bail-outproces. In het geval van de bail-out door calciumvrije zeewater incubatie was de poliepoverleving beperkt tot 1 dag. Zo kan worden geconcludeerd dat de methode niet goed geschikt is voor het voortbestaan op lange termijn van de bestudeerde soorten, of dat een betere aanpassing van de techniek voor P. verrucosa-koralen uit de Rode Zee moet worden gemaakt. De gerapporteerde resultaten toonden aan dat een langere overlevingstijd werd verkregen met de methoden op basis van de geleidelijke toename van het zoutgehalte, wanneer de poliepen werden blootgesteld aan het druppelen van water met een hoog zoutgehalte. Deze methode kan een meer gecontroleerde toename van het zoutgehalte opleveren dan de verdampingsmethode, terwijl het tegelijkertijd niet verantwoordelijk is voor een toename van de concentratie van andere stoffen in het zeewater, waaronder het metabolische afval van het koraal, dat potentieel giftig is voor het organisme. Om al deze redenen is deze methode voorgesteld als een veiliger alternatief voor het behoud van gezonde poliepen27. Hoewel wordt verondersteld dat deze methode veiliger is voor de gezondheid van poliepen en in staat is om poliepen te produceren die langer leven, een feit dat in deze huidige publicatie werd bevestigd, zijn aanvullende onderzoeken nodig om dit te bevestigen. Beide door een hoog zoutgehalte geïnduceerde bail-out experimenten toonden een volledig loslating van poliepen aan nadat het zoutgehalte 59 PSU bereikte in 24 uur. Als het zoutgehalte wordt verhoogd tot voorbij het niveau waarop de bail-out is voltooid, zal verdere stress worden veroorzaakt voor de poliepen, waardoor hun kans om te overleven en te herstellen van de acute stressbehandeling wordt verminderd. Daarom wordt het niet aanbevolen om de poliepen langer in dergelijke zoutgehalteniveaus te houden. Bij het uitvoeren van de bail-out inductiemethode door blootstelling aan calciumvrij zeewater werd een volledige onthechting verkregen uit een incubatie van 3 uur in calciumvrij kunstmatig zeewater, wat betekent dat verdere blootstelling aan dit medium ook niet wordt aanbevolen.
Om de methoden aan te pakken die meer geschikt waren voor de studie van koraalpoliepen in laboratorium / in vitro enquêtes, richtte deze studie zich alleen op drie procedures die bijna 24 uur duurden voordat het bail-outproces was voltooid en werden gebruikt in studies die betrekking hadden op het langetermijnonderhoud van koraalpoliepen van scleractinische koralen. Andere methoden waarvan werd gemeld dat ze aanzienlijk langer duurden dan deze tijd, werden niet ingeschakeld. De zetting van poliepen naar een substraat werd niet geprobeerd in deze studie, die zich richtte op het produceren van poliepen die konden worden overgebracht naar verschillende omgevingen of gemakkelijk konden worden verzameld voor analyses met behulp van wegwerppipetten. De resultaten tonen aan dat poliepen van de koraalsoort P. verrucosa in leven werden gehouden, met geassocieerde zooxanthellae-cellen, een gezonde visuele status en een bewaarde grove externe anatomische structuur, gedurende maximaal 8 weken, zelfs zonder aanhechting aan een substraat. Deze resultaten geven aan dat meer biologische replicaties kunnen worden gegenereerd uit enkele koraalfragmenten met behulp van enkele van de technieken die in deze studie zijn aangetoond. Dergelijke biologische replicaties kunnen worden bewaard in gecontroleerde omgevingen (zoals petrischalen en celkolven) en in laboratoriumomstandigheden worden onderhouden voor experimenten van een maand en voor verschillende doeleinden worden gebruikt.
Sinds de eerste incidentele beschrijvingen van poliep bail-out42,43, zijn nieuwe protocollen opgesteld om meer gestandaardiseerde methoden te vinden voor het induceren van poliepafgifte en het in leven houden van dergelijke poliepen, die kunnen worden gebruikt voor toekomstige onderzoekstoepassingen. Deze omvatten het onderzoeken van verschillende aspecten die verband houden met de koraal holobiontfysiologie44 en gastheer-microbioom interacties45, de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij koraalverbleking 5,25, en de gezondheid, veerkracht en bescherming van de koraal holobiont 12,13,46,47 . Bovendien kunnen vrijgekomen koraalpoliepen worden gebruikt voor toepassingen buiten het domein van onderzoek en is gesuggereerd dat ze nuttig zijn voor het maken van propagules die zich aan een substraat kunnen hechten en groeien, waardoor mogelijk meerdere koraalpersonen kunnen worden gecreëerd die kunnen worden gebruikt voor restauratiedoeleinden zodra gestandaardiseerde protocollen voor bail-out wijdverspreid worden28 . Over het algemeen, hoewel meer diepgaande experimenten met geredde poliepen moeten worden uitgevoerd om de methodologie te standaardiseren, is aangetoond dat poliep bail-out een reproduceerbare benadering is die kan worden toegepast als een hulpmiddel in koraalonderzoek voor verschillende doeleinden.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Adam Barno en Francisca Garcia voor hun steun bij de experimenten en monitoring van de koraalpoliepen. We bedanken ook het KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab voor hun hulp met betrekking tot het onderhoud en de infrastructuur van het aquarium. De studie werd gefinancierd door KAUST-subsidienummer BAS/1/1095-01-01.
5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
Percival Incubator – I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |