Numerosas novas sequências semelhantes a vírus foram encontradas em mosquitos devido ao uso extensivo de tecnologias de sequenciamento. Fornecemos um procedimento eficaz para isolar e amplificar vírus usando linhagens celulares de vertebrados e mosquitos, que pode servir de base para estudos futuros sobre vírus associados a mosquitos, incluindo vírus transmitidos por mosquitos e específicos por mosquitos.
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Artigo de método
Isolamento de vírus associados a mosquitos coletados em campo
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Com a ampla aplicação de tecnologias de sequenciamento, muitas novas sequências semelhantes a vírus foram descobertas em artrópodes, incluindo mosquitos. As duas principais categorias desses novos vírus associados a mosquitos são "vírus transmitidos por mosquitos (MBVs)" e "vírus específicos de mosquitos (MSVs)". Esses novos vírus podem ser patogênicos para vertebrados e mosquitos, ou podem ser apenas simbióticos com mosquitos. Vírus de entidade são essenciais para confirmar os caracteres biológicos desses vírus. Assim, um protocolo detalhado foi descrito aqui para isolamento e amplificação de vírus a partir de mosquitos coletados em campo. Primeiramente, as amostras de mosquitos foram preparadas como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Após centrifugação duas vezes, os sobrenadantes foram inoculados na linhagem celular de mosquito C6/36 ou na linhagem celular de vertebrado BHK-21 para amplificação do vírus. Após 7 dias, os sobrenadantes foram coletados como sobrenadantes P1 e armazenados a -80 °C. Em seguida, os sobrenadantes P1 foram passados mais duas vezes em células C6/36 ou BHK-21 enquanto o status celular estava sendo verificado diariamente. Quando o efeito citopatogênico (CPE) sobre as células foi descoberto, esses sobrenadantes foram coletados e usados para identificar vírus. Este protocolo serve como base para pesquisas futuras sobre vírus associados a mosquitos, incluindo MBVs e MSVs.
Introdução
Os mosquitos são um grupo de importantes artrópodes vetores patogênicos. Existem aproximadamente 3.500 espécies de mosquitos na família Culicidae 1,2. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento levou à descoberta de muitas sequências novas semelhantes a vírus em mosquitos de diferentes partes do mundo3. Geralmente, esses vírus associados a mosquitos podem ser classificados em dois grupos principais: MBVs e MSVs.
Os MBVs são um grupo de diversos vírus que são agentes causadores de muitas doenças humanas ou animais, como o vírus da fe....
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Protocolo
1. Amostragem e triagem de mosquitos
- Prender os mosquitos adultos através das armadilhas de luz MXA-02 ou armadilhas de mosquitos de dióxido de carbono no campo.
- Matar os mosquitos coletados mergulhando em nitrogênio líquido10,11. Transportá-los para o laboratório pelo sistema logístico da cadeia de frio12.
NOTA: O gelo seco foi usado principalmente no sistema logístico da cadeia fria. - (Opcional) Se os locais de coleta estiverem próximos ao laboratório, enviar diretamente os mosquitos vivos nas armadilhas de rede para o laboratório e eut....
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Resultados
Após a inoculação com os sobrenadantes dos homogeneizados do mosquito (P0), as células C6/36 exibiram um amplo espaço intercelular, e células esfoliadas foram observadas em 120 h (Figura 1A) em comparação com as células não inoculadas (controle) ao mesmo tempo (Figura 1B). Após incubação das células BHK-21 com o sobrenadante P3, observou-se CPE visível nas células BHK-21 em 48 h (Figura 1C), em contraste com as células controle (
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Discussão
O objetivo deste método foi oferecer uma maneira prática de isolar vírus associados a mosquitos usando várias linhagens celulares. É fundamental adicionar o Antibiotico-Antimicótico (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina) aos sobrenadantes dos homogeneizados do mosquito para evitar a contaminação por bactérias ou fungos. Os mosquitos e sobrenadantes virais obtidos no campo devem ser refrigerados a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
Outro passo crítico no prot.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ Filtro de membrana | Millipore | SLGP033RB | Filmes de polímero com classificações de poros específicas. Para remover detritos celulares e bactérias. |
| Placas de 24 poços | CORNING | 3524 | Recipientes para |
| frascos de células de 75 cm2 | CORNING | 430641 | Recipientes para célula |
| um tubo estéril de 2 mL com esferas | |||
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240-062 | Antibiótico no meio para evitar a contaminação por bactérias e fungos |
| Ácido nucleico automatizado sistema de extração | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 células | Nacional de Recursos de Vírus, Instituto de Virologia | ||
| C6 / 36 células | Centro Nacional de Recursos de Vírus, Instituto de Virologia | ||
| Máquina centrífuga | Himac | CF16RN | Instrumento para centrifugação de amostras de mosquitos |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s meio essencial mínimo (DMEM) | Gibco | C11995500BT | meio para linhas celulares de vertebrados |
| Isolamento do vírus | Ebinur Lake Cu20-XJ Soro | ||
| bovino feta (FBS) | Gibco | 10099141C | Fornecer nutrição para células |
| homogeneizador de tecidos de alta velocidade e baixa temperatura | servicebio | KZ-III-F | Instrumento para moagem |
| incubadora (28 ° C) | Instrumento Panasonic | MCO-18AC | de cultura de células |
| (37 ° C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrumento para cultura de células |
| Tubo | |||
| penicilina-estreptomicina | Gibco | 15410-122 | Antibiótico no meio para evitar a contaminação por bactérias |
| Penicilina-estreptomicina-Anfotericina B Solução | Gibco | 15240096 | |
| Geladeira (-80 ° C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium para linhas celulares mosiquto |
| Tubos de armazenamento com tampa de rosca (2 mL) | biofil | ||
| pilões estéreis | Tiangen | OSE-Y004 | Consumíveis para moagem |
| TGrinder OSE-Y30 moedor elétrico de tecidos | Tiangen | OSE-Y30 | Instrumento para moagem |
| O microscópio de dissecação | ZEISS | stemi508 | |
| as armadilhas de luz MXA-02 | Maxttrac | ||
| A máquina | de absorção de mosquitosNingbo Bangning | ||
| As pontas da pipeta | Axygen | TF | |
| O mini kit de RNA viral QIAamp | QIAGEN | 52906 | |
| Pinças | Dumont | 0203-5-PO |
Referências
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....
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Reimpressões e permissões
