Tecniche molecolari e immunologiche in un modello murino geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale
Summary
L’obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere il modello murino KitV558Δ/+ e le tecniche per la dissezione e l’elaborazione di campioni di topo.
Abstract
Il tumore stromale gastrointestinale (GIST) è il sarcoma umano più comune ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nel recettore KIT. Tra i tipi di tumore, sono stati sviluppati numerosi modelli murini al fine di studiare la prossima generazione di terapie contro il cancro. Tuttavia, in GIST, la maggior parte degli studi in vivo utilizza modelli murini con xenotrapianto che presentano limitazioni intrinseche. Qui, descriviamo un modello murino immunocompetente e geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale che ospita una mutazione KitV558Δ / + . In questo modello, il KIT mutante, l’oncogene responsabile della maggior parte dei GIST, è guidato dal suo promotore endogeno che porta a un GIST che imita l’aspetto istologico e l’infiltrato immunitario visto nei GIST umani. Inoltre, questo modello è stato utilizzato con successo per studiare sia terapie molecolari mirate che immunitarie. Qui descriviamo l’allevamento e il mantenimento di una colonia di topi KitV558Δ/+ . Inoltre, questo documento descrive in dettaglio il trattamento e l’approvvigionamento di GIST, drenaggio del linfonodo mesenterico e cieco adiacente nei topi KitV558Δ / + , nonché la preparazione del campione per analisi molecolari e immunologiche.
Introduction
GIST è il sarcoma più comune negli esseri umani con un’incidenza di circa 6.000 casi negli Stati Uniti d’America1. GiST sembra provenire dalle cellule pacemaker gastrointestinali chiamate cellule interstiziali di Cajal ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nella tirosin-chinasi KIT o PDGFRA2. La chirurgia è il pilastro del trattamento per GIST e può essere curativa, ma i pazienti con malattia avanzata possono essere trattati con l’inibitore della tirosin-chinasi (TKI), imatinib. Dalla sua introduzione oltre 20 anni fa, imatinib ha trasformato il paradigma di trattamento in GIST, migliorando la sopravvivenza nella malattia avanzata da 1 a oltre 5 anni 3,4,5. Sfortunatamente, imatinib è raramente curativo a causa delle mutazioni KIT acquisite, quindi sono necessari nuovi trattamenti per questo tumore.
I modelli murini sono un importante strumento di ricerca nello studio di nuove terapie nel cancro. In GIST 6,7 sono stati sviluppati e studiati più modelli di xenotrapianto sottocutaneo e derivati dal paziente. Tuttavia, i topi immunodeficienti non rappresentano pienamente il GIST umano poiché i GIST ospitano profili immunitari differenziali a seconda della loro mutazione oncogenica e l’alterazione del microambiente tumorale gastrointestinale migliora gli effetti della terapia TKI 8,9. Il topo KitV558Δ/+ ha una delezione della linea germinale eterozigote nell’esone Kit 11, che codifica nel dominio juxtamembrane, il sito più comunemente mutato nel GIST10 umano. I topi del kitV558Δ/+ sviluppano un singolo GIST cecale con penetranza al 100% e i tumori hanno istologia, segnalazione molecolare, infiltrazione immunitaria e risposta alla terapia simili a quelle umane di GIST 8,11,12,13. Qui, descriviamo l’allevamento, il trattamento e l’isolamento e l’elaborazione dei campioni nei topi KitV558Δ / + per l’uso nella ricerca molecolare e immunologica in GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modellomurino Kit V558Δ/+ è un potente strumento di ricerca nell’analisi molecolare e immunologica del GIST. Sebbene la strategia di allevamento richieda un singolo incrocio, l’utilizzo di coorti di topi KitV558Δ/+ in esperimenti di analisi della risposta tumorale richiede un allevamento estensivo. I topi dovrebbero essere abbinati all’età e al sesso per garantire pesi tumorali simili e il 10% dei topi muore prima delle 8 settimane di età quando i tumori sono stabiliti. Str…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I topi KitV558Δ/+ sono stati geneticamente modificati e condivisi dal Dr. Peter Besmer10. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01 CA102613 e T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
Referências
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