Caco-2-cellbioassay för mätning av biotillgänglighet för livsmedelsjärn
Summary
Caco-2-cellbioassay för järn (Fe) biotillgänglighet representerar ett kostnadseffektivt och mångsidigt tillvägagångssätt för att bedöma Fe-biotillgänglighet från livsmedel, livsmedelsprodukter, kosttillskott, måltider och till och med dietregimer. Grundligt validerad till mänskliga studier, representerar den senaste tekniken för studier av Fe biotillgänglighet.
Abstract
Kunskap om Fe-biotillgänglighet är avgörande för bedömningen av näringskvaliteten hos Fe i livsmedel. In vivo-mätning av Fe-biotillgänglighet begränsas av kostnad, genomströmning och de försiktighetsåtgärder som är inneboende i isotopmärkning av maten Fe. Det finns således ett kritiskt behov av ett tillvägagångssätt som är högt genomströmnings- och kostnadseffektivt. Caco-2-cellbioassay utvecklades för att tillgodose detta behov. Caco-2-cellbioassay för Fe-biotillgänglighet använder simulerad mag- och tarmsmältning i kombination med odling av en human tarmepitelcellinje som kallas Caco-2. I Caco-2-celler stimulerar Fe-upptag den intracellulära bildningen av ferritin, ett Fe-lagringsprotein som lätt mäts med enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). Ferritinformer i proportion till Fe-upptaget; genom att mäta Caco-2-cellferritinproduktionen kan man således bedöma tarmens Fe-upptag från simulerade matsmältningar till enterocyten.
Via detta tillvägagångssätt replikerar modellen det viktigaste inledande steget som bestämmer livsmedels-Fe-biotillgängligheten. Sedan starten 1998 har denna modellmetod noggrant jämförts med faktorer som är kända för att påverka mänsklig Fe-biotillgänglighet. Dessutom har det tillämpats i parallella studier, med tre humana effektstudier som utvärderar Fe biofortifierade grödor. I alla fall förutspådde bioassay korrekt de relativa mängderna Fe-biotillgänglighet från faktorerna, grödorna och den totala kosten. Detta dokument ger detaljerade metoder för Caco-2-cellodling i kombination med in vitro-matsmältningsprocessen och cellferritin ELISA som är nödvändig för att genomföra Caco-2-cellbioassay för Fe-biotillgänglighet.
Introduction
För att fullt ut förstå forskningsbehovet och nyttan av Caco-2-cellbioassay för Fe-biotillgänglighet måste man först förstå de tillvägagångssätt som fanns på plats före tillkomsten av denna modell. Mätningen av Fe-biotillgängligheten från ett livsmedel eller en måltid in vivo är en utmanande uppgift, särskilt när kombinationer av livsmedel måste bedömas i en måltid eller kost. Isotopmärkning har varit det vanligaste tillvägagångssättet för mätning av Fe-biotillgänglighet under de senaste 50 åren1. Isotopmärkning används för studier av en måltid och flera måltider och är opraktiskt för långtidsstudier. Stabila isotoper av Fe såsom 57Fe och 58Fe är de vanligaste; studier har dock utförts med radioisotoper som 59Fe, med användning av helkroppsräkning2. För vegetabiliska livsmedel har isotopmärkning gjorts via yttre eller inneboende märkning. För yttre märkning tillsätts en känd mängd isotop till maten eller måltiden. Maten blandas sedan och en jämviktsperiod på 15-30 minuter införlivas i protokollet före konsumtionen. Hydroponisk kultur – att lägga till isotopen till näringslösningen för att införliva den i växten medan den växer och utvecklas – krävs för den inneboende märkningen av vegetabiliska livsmedel. Fördelarna och nackdelarna med varje tillvägagångssätt diskuteras nedan.
Extrinsisk isotopmärkning
I början till mitten av 1970-talet studerades human Fe-absorption genom yttre märkning av Fe i livsmedel, vari en känd mängd isotop tillsätts till den kända mängden Fe i maten eller måltiden, blandad och jämvikt i 15-30 minuter före mätningar. Olika mängder yttre isotoper har använts, allt från 1% till 100% av den inneboende Fe, men oftast i intervallet 7% -30% 3. Extrinsisk märkning bygger på antagandet att den yttre Fe-isotopen blir helt jämställd med matens eller måltidens inneboende Fe. Extrinsisk isotopabsorption mäts sedan, och varje atom i den yttre isotopen beräknas för att representera ett givet antal inneboende Fe-atomer. Denna beräkning baseras på de relativa molära mängderna. År 1983 sammanfattades flera valideringsstudier av tekniken i ett översiktspapper4. Validering av tekniken gjordes genom att samtidigt jämföra den procentuella absorptionen av den yttre isotopetiketten med den procentuella absorptionen av en inneboende isotopetikett. Således tyder ett förhållande mellan den yttre och inneboende absorptionen nära 1 på att varje pool av Fe absorberades lika. Vid den tiden ansågs ett förhållande nära 1 också representera jämvikt mellan den yttre isotopen och matens eller måltidens inneboende Fe. Förhållandet mellan yttre och inneboende Fe-absorption varierade från medelvärden på 0,40 till 1,62, med ett medelvärde (±SD) på 1,08 ± 0,14 i 63 jämförelser. Det är viktigt att notera att i alla studier som sammanfattas i denna översyn testade ingen direkt jämvikten mellan den yttre etiketten och den inneboende Fe. Sammanfattningsvis drog författarna till översynen följande slutsatser:
” Den yttre taggtekniken har visat sig vara giltig för flera livsmedel under vissa experimentella förhållanden. Men denna metod kan ännu inte anses vara bevisad när det gäller alla typer av livsmedel. Den yttre taggmetoden är inte lämplig för att övervaka järnabsorptionen från en diet som innehåller olösliga former av järn. Giltigheten av denna teknik bygger på det grundläggande antagandet att den yttre taggen utbyter helt med allt endogent nonheme matjärn. För närvarande är det inte känt hur fullständigt de olika formerna av nonheme järn är märkta med en yttre tagg. Detta är viktigt mot bakgrund av studier som har föreslagit att järnhämmare kan påverka den yttre taggen annorlunda än vissa former av nonheme järn i livsmedel. Forskning om livsmedelsfaktorer som kan försämra ett fullständigt isotoputbyte är knapphändig. Således kräver tolkning av biotillgänglighetsdata från extrinsisk taggforskning övervägande av utbyteshämmare som kan finnas i maten eller kosten.
Sedan 1983 har endast två studier publicerats som utvärderade noggrannheten i yttre märkning av Fe 3,5. I båda dessa studier jämfördes jämvikten av en yttre isotopetikett direkt med livsmedlens inneboende Fe, som i dessa studier var basmatgrödor. Vita, röda och svarta bönsorter testades, tillsammans med linser och majs. Med hjälp av etablerade in vitro-rötningstekniker och mätning av Fe-löslighet och nederbörd visade båda studierna att yttre isotopmärkning inte konsekvent resulterar i full jämvikt, med bevis för att för vissa bönsorter kan felbalansen vara mycket hög beroende på mängden yttre isotop och fröbeläggningsfärg3. Trots slutsatserna i 1983 års översiktsdokument fortsatte extrinsiska märkningsstudier av bönor 6,7,8,9,10,11,12. Ingen av dessa studier inkluderade testning av jämvikten mellan den yttre etiketten och den inneboende Fe.
Inneboende märkning
Inneboende märkning av växtmat för bedömning av Fe-biotillgänglighet eliminerar noggrannhetsproblemen med jämvikt vid yttre märkning. Detta tillvägagångssätt kan emellertid inte ge stora mängder material på grund av kravet på växthusutrymme för hydroponisk kultur. Hydroponisk odling är arbetsintensiv, kräver en stor mängd dyra stabila isotoper och resulterar ofta i växttillväxt som skiljer sig åt när det gäller utbyte och frö Fe-koncentration. På grund av kostnaden är inneboende märkning endast lämplig för småskaliga studier som syftar till att förstå mekanismer som ligger till grund för Fe-upptag eller faktorer som påverkar Fe-upptag från livsmedel. Produktion av 1-2 kg av en basföda kostar cirka $ 20,000- $ 30,000 för material ensam, beroende på isotopen och hydroponisk metod13,14.
Med tanke på de utmaningar som är förknippade med isotopmärkning försökte utredarna utveckla in vitro-metoder. Tidiga metoder använde simulerad mag- och tarmmat, i kombination med mätning av Fe-löslighet eller Fe-dialyserbarhet som en uppskattning av biotillgänglighet15. Sådana studier fann snabbt att Fe-dialyserbarhet inte var ett konsekvent mått på biotillgänglighet eftersom Fe kan vara lösligt, tätt bundet till föreningar och därför inte utbytbart, vilket leder till överskattning av biotillgängligheten. För att ta itu med dessa problem utvecklades metodiken för att använda en mänsklig tarmcellinje, vilket tillförde en levande komponent och möjliggjorde mätning av Fe-upptag16. De mänskliga tarmcellerna-Caco-2-celler-härstammar från ett humant kolonkarcinom och har använts i stor utsträckning i näringsupptagsstudier. Denna cellinje är användbar eftersom cellerna i odling differentieras till enterocyter som fungerar på samma sätt som tunntarmens borstgränsceller. Studier har visat att Caco-2-celler uppvisar lämpliga transportörer och svar på faktorer som påverkar Fe-upptag17,18.
De inledande studierna, som använde radioisotoper för att mäta Fe-upptag i Caco-2-celler, förfinades för att mäta Fe-upptag baserat på Caco-2-cellferritinbildning. Caco-2-cellferritinmätning förbättrade provgenomströmningen och förnekade problem med radioisotophantering och jämvikt mellan yttre Fe och inneboende Fe19,20. Mätning av Fe-upptag via ferritinbildning gjorde det möjligt för forskare att studera ett brett spektrum av livsmedel, inklusive komplexa måltider21. Således gav simulerad (in vitro) matsmältning i kombination med Caco-2-cells Fe-upptag en bättre fysiologisk bedömning av Fe-upptag från livsmedel. Det är viktigt att notera att denna modell främst bestämmer relativa skillnader i Fe-biotillgänglighet. Liksom många användbara cellinjer har Caco-2-celler också visat variation i lyhördhet men har bibehållit konsekventa relativa skillnader i Fe-upptag mellan livsmedel. Korrekt teknik och noggrann uppmärksamhet på detaljer kan förbättra konsekvent cellferritinbildningssvar i Caco-2-celler.
In vitro-digestion/Caco-2-cellmodellen är också känd som Caco-2-cellbioassay. Denna analys har validerats grundligt genom direkt jämförelse med studier på människor och djur22. Förutom den direkta parallella jämförelsen av bioassay med humana effektstudier har denna modell visat sig uppvisa ett kvalitativt liknande svar i Fe-upptag som hos människor18,19,23. Därför, som ett in vitro-tillvägagångssätt, garanterar Caco-2-cellbioassay hög trovärdighet som ett screeningverktyg för att utvärdera Fe-näring från livsmedel. Det har tillämpats i stor utsträckning på många livsmedel och livsmedelsprodukter 21,24,25,26,27,28.
Sedan starten 1998 har Caco-2-cellbioassay avancerat fältet Fe-näring eftersom det har hjälpt till att identifiera faktorer som påverkar intestinal Fe-upptag. På så sätt har denna modell utvecklat och förfinat forskningsmål för mer definitiva och mindre kostsamma mänskliga studier. Man kan också hävda att användningen av modellen förnekar behovet av vissa mänskliga prövningar.
Sammanfattningsvis kan den relativa leveransen av Fe från en mat eller måltid mätas med Caco-2-cellbioassay. Oavsett mängden Fe i testmjölet definierar bioassay den relativa mängden Fe som tas upp i enterocyten – det första steget i absorptionsprocessen. Detta är det viktigaste steget för att definiera Fe-biotillgänglighet, eftersom målet oftast är att mäta med avsikt att förbättra eller åtminstone övervaka näringskvaliteten hos Fe i ett livsmedel. Med tanke på att järnstatus regleras av absorption, och därmed är Fe-upptaget uppreglerat hos Fe-bristfälliga individer för att tillgodose näringsbehov, är modellens standardvillkor utformade så att Fe-upptaget av cellerna är maximalt. På detta sätt ger bioassay ett verkligt mått på matens potential att leverera Fe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sedan starten har många studier publicerats som beskriver denna metod för Caco-2-cellbioassay. Grundförutsättningarna har varit relativt oförändrade sedan den första publiceringen 199818. Under de senaste 20 åren har dock många tekniska detaljer förfinats och standardiserats för att ge oöverträffad konsistens i bioassayens svar. Noggrann och exakt följsamhet till cellkulturen och in vitro-matsmältningsförhållandena är nyckeln till det konsekventa och känsliga svaret fr?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren är djupt tacksam för Yongpei Changs och Mary Bodis tekniska ansträngningar. Den extremt framgångsrika tillämpningen av denna modell inom näringsområdet är ett direkt resultat av deras expertis och uppmärksamhet på detaljer. Utvecklingen av denna modell finansierades helt av Förenta staternas jordbruksdepartement, jordbruksforskningstjänst.
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
Referências
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O’Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
