Caco-2-cellebioanalysen for måling av biotilgjengelighet av matjern

Summary

Caco-2-cellebioassay for jern (Fe) biotilgjengelighet representerer en kostnadseffektiv og allsidig tilnærming for å vurdere Fe-biotilgjengelighet fra matvarer, matvarer, kosttilskudd, måltider og til og med diettregimer. Grundig validert til menneskelige studier, representerer det toppmoderne for studier av Fe biotilgjengelighet.

Abstract

Kunnskap om Fe biotilgjengelighet er avgjørende for vurderingen av næringskvaliteten til Fe i matvarer. In vivo-måling av Fe-biotilgjengelighet er begrenset av kostnad, gjennomstrømning og forbeholdene som er forbundet med isotopisk merking av maten Fe. Dermed eksisterer det et kritisk behov for en tilnærming som er høy gjennomstrømning og kostnadseffektiv. Caco-2-cellebioassay ble utviklet for å tilfredsstille dette behovet. Caco-2-cellebioassayet for Fe-biotilgjengelighet benytter simulert mage- og tarmfordøyelse kombinert med kultur av en human tarmepitelcellelinje kjent som Caco-2. I Caco-2-celler stimulerer Fe-opptak den intracellulære dannelsen av ferritin, et Fe-lagringsprotein som lett måles ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Ferritinformer i forhold til Fe-opptak; Ved å måle Caco-2-celleferritinproduksjon kan man således vurdere intestinal Fe-opptak fra simulerte matfordøyelser inn i enterocytten.

Via denne tilnærmingen replikerer modellen det viktigste første trinnet som bestemmer mat Fe biotilgjengelighet. Siden starten i 1998 har denne modelltilnærmingen blitt grundig sammenlignet med faktorer som er kjent for å påvirke menneskelig Fe-biotilgjengelighet. Videre har det blitt brukt i parallelle studier, med tre humane effektstudier som evaluerer Fe biofortifiserte avlinger. I alle tilfeller forutslo bioassayet riktig de relative mengdene Fe-biotilgjengelighet fra faktorene, avlingene og det generelle kostholdet. Dette papiret gir detaljerte metoder for Caco-2-cellekultur kombinert med in vitro fordøyelsesprosessen og celleferritin ELISA som er nødvendig for å utføre Caco-2-cellebioassay for Fe-biotilgjengelighet.

Introduction

For å fullt ut forstå forskningsbehovet og fordelen med Caco-2-cellebioassay for Fe-biotilgjengelighet, må man først forstå tilnærmingene som var på plass før ankomsten av denne modellen. Måling av Fe-biotilgjengelighet fra mat eller måltid in vivo er en utfordrende oppgave, spesielt når kombinasjoner av mat må vurderes i et måltid eller diett. Isotopmerking har vært den vanligste tilnærmingen for måling av Fe-biotilgjengelighet de siste 50 årene¹. Isotopisk merking brukes til studier med ett måltid og flere måltider og er upraktisk for langtidsstudier. Stabile isotoper av Fe som ⁵⁷Fe og ⁵⁸Fe er de mest brukte; Imidlertid har studier blitt utført med radioisotoper som ⁵⁹Fe, ved bruk av helkroppstelling². For plantefôr har isotopmerking blitt gjort via ekstrinsisk eller inneboende merking. For ekstrinsisk merking tilsettes en kjent mengde isotop til maten eller måltidet. Maten blandes deretter, og en 15-30 min likevektsperiode innlemmes i protokollen før forbruket. Hydroponisk kultur – tilsetning av isotopen til næringsoppløsningen for å innlemme den i planten mens den vokser og utvikler seg – er nødvendig for egen merking av plantefôr. Fordeler og ulemper ved hver tilnærming er diskutert nedenfor.

Ekstrinsisk isotopisk merking
I begynnelsen til midten av 1970-tallet ble human Fe-absorpsjon studert ved ekstrinsisk merking av Fe i matvarer, hvor en kjent mengde isotop legges til den kjente mengden Fe i maten eller måltidet, blandet og likevektet i 15-30 minutter før målinger. Ulike mengder ekstrinsiske isotoper har blitt brukt, alt fra 1% til 100% av den inneboende Fe, men oftest i området 7% -30% ³. Ekstrinsisk merking er basert på antagelsen om at den ekstrinsiske Fe-isotopen blir fullt likevektet med den inneboende Fe av maten eller måltidet. Ekstrinsisk isotopabsorpsjon måles deretter, og hvert atom av den ekstrinsiske isotopen beregnes å representere et gitt antall inneboende Fe-atomer. Denne beregningen er basert på de relative molare mengdene. I 1983 ble flere valideringsstudier av teknikken oppsummert i en oversiktsartikkel⁴. Validering av teknikken ble gjort ved samtidig å sammenligne prosentabsorpsjonen av den ekstrinsiske isotopetiketten med prosentabsorpsjonen av en inneboende isotopetikett. Dermed antyder et forhold mellom ekstrinsisk og inneboende absorpsjon nær 1 at hvert basseng av Fe ble absorbert likt. På den tiden ble et forhold nær 1 også ansett å representere likevekt av den ekstrinsiske isotopen med den inneboende Fe av maten eller måltidet. Forholdet mellom ekstrinsisk og intrinsisk Fe-absorpsjon varierte fra gjennomsnittsverdier på 0,40 til 1,62, med et gjennomsnittlig (±SD) forhold på 1,08 ± 0,14 i 63 sammenligninger. Det er viktig å merke seg at i alle studiene oppsummert i denne anmeldelsen, testet ingen direkte likevekten av den ekstrinsiske etiketten med den inneboende Fe. Oppsummert konkluderte forfatterne av oversikten med følgende:

– Den ekstrinsiske merketeknikken har vist seg å være gyldig for flere matvarer under visse eksperimentelle forhold. Men denne metoden kan ennå ikke betraktes som bevist med hensyn til alle typer matvarer. Den ekstrinsiske tag-metoden er ikke egnet for å overvåke jernabsorpsjon fra en diett som inneholder uoppløselige former for jern. Gyldigheten av denne teknikken er avhengig av den grunnleggende antagelsen om at den ekstrinsiske taggen utveksler helt med alt endogent nonheme matjern. For tiden er det ikke kjent hvor fullstendig de forskjellige formene for nonheme jern er merket av en ekstrinsisk tag. Dette er viktig i lys av studier som har antydet at jernhemmere kan påvirke ekstrinsisk tag annerledes enn noen former for nonheme jern i matvarer. Forskning på matfaktorer som kan svekke en komplett isotoputveksling er liten. Dermed krever tolkning av biotilgjengelighetsdata fra ekstrinsisk tagforskning vurdering av inhibitorer av utveksling som kan være tilstede i maten eller dietten.

Siden 1983 har bare to studier blitt publisert som evaluerte nøyaktigheten av ekstrinsisk merking av Fe ^3,5. I begge disse studiene ble likevekten av en ekstrinsisk isotopisk etikett direkte sammenlignet med den inneboende Fe av matvarene, som i disse studiene var stiftmatavlinger. Hvite, røde og svarte bønnesorter ble testet, sammen med linser og mais. Ved å bruke etablerte in vitro fordøyelsesteknikker og måling av Fe-løselighet og nedbør, viste begge studiene at ekstrinsisk isotopmerking ikke konsekvent resulterer i full likevekt, med bevis på at for noen bønnevarianter kan ulikheten være svært høy avhengig av mengden ekstrinsisk isotop og frøbeleggfarge³. Til tross for konklusjonene fra 1983-gjennomgangspapiret fortsatte ekstrinsiske merkingsstudier av bønner 6,7,8,9,10,11,12. Ingen av disse studiene inkluderte testing av likevekten av den ekstrinsiske etiketten med den indre Fe.

Egenmerking
Egenmerking av plantefôr for vurdering av Fe-biotilgjengelighet eliminerer nøyaktighetsproblemene med likevekt i ekstrinsisk merking. Denne tilnærmingen kan imidlertid ikke gi store mengder materiale på grunn av kravet om drivhusplass for hydroponisk kultur. Hydroponisk kultur er arbeidsintensiv, krever en høy mengde dyr stabil isotop, og resulterer ofte i plantevekst forskjellig når det gjelder utbytte og frø Fe-konsentrasjon. På grunn av kostnadene er egenmerking bare egnet for småskalastudier som tar sikte på å forstå mekanismer som ligger til grunn for Fe-opptak eller faktorer som påvirker Fe-opptak fra matvarer. Produksjon av 1-2 kg av en stiftmatavling koster omtrent $ 20.000 – $ 30.000 for materialer alene, avhengig av isotop og hydroponisk tilnærming^13.14.

Gitt utfordringene knyttet til isotopmerking, forsøkte etterforskerne å utvikle in vitro-tilnærminger. Tidlige metoder benyttet simulert mage- og tarmmat, kombinert med måling av Fe-løselighet eller Fe-dialyserbarhet som et estimat av biotilgjengelighet¹⁵. Slike studier fant raskt at Fe-dialyserbarhet ikke var et konsistent mål på biotilgjengelighet, da Fe kan være løselig, tett bundet til forbindelser og derfor ikke utskiftbar, noe som fører til overestimering av biotilgjengelighet. For å løse disse problemene utviklet metodikken for å utnytte en human tarmcellelinje, og dermed legge til en levende komponent og muliggjøre måling av Fe-opptak¹⁶. De humane tarmcellene – Caco-2-celler – stammer fra et humant kolonkarsinom og har blitt mye brukt i næringsopptaksstudier. Denne cellelinjen er nyttig da cellene i kultur skiller seg ut i enterocytter som fungerer på samme måte som tynntarmens børstekantceller. Studier har vist at Caco-2-celler viser passende transportører og respons på faktorer som påvirker Fe-opptaket^17,18.

De første studiene, som benyttet radioisotoper for å måle Fe-opptak i Caco-2-celler, ble raffinert for å måle Fe-opptak basert på Caco-2-celleferritindannelse. Caco-2-celleferritinmåling forbedret prøvegjennomstrømning og negerte problemer med radioisotophåndtering og likevekt av ekstrinsisk Fe med inneboende Fe^19,20. Måling av Fe-opptak via ferritindannelse gjorde det mulig for forskere å studere et bredt spekter av matvarer, inkludert komplekse måltider²¹. Dermed ga simulert (in vitro) fordøyelse kombinert med Caco-2-celle Fe-opptak en bedre fysiologisk vurdering av Fe-opptak fra matvarer. Det er viktig å merke seg at denne modellen først og fremst bestemmer relative forskjeller i Fe-biotilgjengelighet. Som mange nyttige cellelinjer har Caco-2-celler også vist variasjon i respons, men har opprettholdt konsistente relative forskjeller i Fe-opptak mellom matvarer. Riktig teknikk og nøye oppmerksomhet på detaljer kan forbedre konsistent celleferritindannelsesrespons i Caco-2-celler.

In vitro fordøyelsen / Caco-2 cellemodellen er også kjent som Caco-2 cellebioassay. Denne analysen har blitt grundig validert via direkte sammenligning med studier på mennesker og dyr²². I tillegg til den direkte parallelle sammenligningen av bioassay til humane effektforsøk, har denne modellen vist seg å vise en kvalitativt lik respons i Fe-opptak til den for mennesker^18,19,23. Derfor, som en in vitro-tilnærming, garanterer Caco-2-cellebioassay høy troverdighet som et screeningsverktøy for å evaluere Fe-ernæring fra matvarer. Det har blitt mye brukt på mange matvarer og matvarer 21,24,25,26,27,28.

Siden starten i 1998 har Caco-2-cellebioassay avansert feltet Fe-ernæring, da det har bidratt til å identifisere faktorer som påvirker intestinal Fe-opptak. På denne måten har denne modellen utviklet og raffinert forskningsmål for mer definitive og mindre kostbare menneskelige studier. Man kan også argumentere for at bruken av modellen negerer behovet for noen menneskelige forsøk.

Oppsummert kan den relative leveransen av Fe fra en mat eller et måltid måles med Caco-2-cellebioassay. Uavhengig av mengden Fe i testmåltidet, definerer bioassay den relative mengden Fe tatt opp i enterocytten – det første trinnet i absorpsjonsprosessen. Dette er det viktigste trinnet i å definere Fe-biotilgjengelighet, da målet oftest er å måle med den hensikt å forbedre eller i det minste overvåke næringskvaliteten til Fe i en mat. Gitt at jernstatus reguleres av absorpsjon, og dermed Fe-opptak er oppregulert hos Fe-mangelfulle individer for å møte ernæringsmessige behov, er standardbetingelsene for modellen utformet slik at Fe-opptak av cellene er maksimalt. På denne måten gir bioassay et sant mål på potensialet til maten for å levere Fe.

Protocol

MERK: Som et praktisk referansepunkt for leserne beskriver følgende metodikk de spesifikke kulturforholdene og materialene som kreves for måling av Fe-biotilgjengelighet fra 20 eksperimentelle prøver, pluss de nødvendige kvalitetskontrollene, i en kjøring av bioassay. Økning av antall prøver utover denne kapasiteten anbefales ikke på grunn av tiden som kreves for ulike cellekulturer og in vitro fordøyelsestrinn i bioassay. 1. Velge antall prøver Fo…

Representative Results

Identifisering og måling av Fe-biotilgjengelighet i basismatavlingerEn av de viktigste grunnene til å utvikle denne modellen var å identifisere faktorer som påvirker Fe-biotilgjengeligheten i stiftmatavlinger og gi et verktøy for planteoppdrettere som ville gjøre dem i stand til å identifisere og utvikle varianter med forbedret Fe-biotilgjengelighet. Den vanlige bønnen (Phaseolus vulgaris) har blitt målrettet globalt som en avling for Fe biofortification; dermed har modellen blitt b…

Discussion

Siden starten har det blitt publisert mange studier som beskriver denne metoden for Caco-2-cellebioassay. De grunnleggende forholdene har vært relativt uendret siden den første publiseringen i 1998¹⁸. I løpet av de siste 20 årene har imidlertid mange tekniske detaljer blitt raffinert og standardisert for å gi enestående konsistens i responsen til bioassay. Forsiktig og presis overholdelse av cellekulturen og in vitro fordøyelsesforhold er nøkkelen til konsistent og sensitiv respon…

Materials

0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water			Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma Aldrich Co	T6397
6-well plates	Costar	3506	Use for bioassay experiments
ascorbic acid	Sigma Aldrich Co	A0278
bile extract	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 cells	American Type Culture Collection	HTB-37	HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225	Falcon	353138
Cell culture flasks T25	Corning	430639
Cell culture flasks T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen	Corning	354236
dialysis membrane	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	12100046	DMEM
epidermal growth factor	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit	Eagle Biosciences	FRR31-K01
fetal bovine serum	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
Hydrocortisone-Water Soluble	Sigma Aldrich Co	H0396
insert ring	Corning Costar	not sold	Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
large column	VWR International	KT420400-1530
Minimum Essential Medium	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
pancreatin	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES disodium salt	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin	Sigma Aldrich Co	P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit	Bio-Rad Laboratories Inc	Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116	Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233
Sodium selenite	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific