قد تؤثر ميكروبات الأمعاء بشكل إيجابي أو سلبي على صحة مضيفها من خلال آليات محددة أو محفوظة. Caenorhabditis elegans هي منصة ملائمة لفحص مثل هذه الميكروبات. يصف البروتوكول الحالي الفحص عالي الإنتاجية ل 48 عزلة بكتيرية للتأثير على مقاومة إجهاد الديدان الخيطية ، ويستخدم كبديل لصحة الديدان.
بفضل صغر حجمها وعمرها القصير وسهولة علم الوراثة ، توفر Caenorhabditis elegans منصة ملائمة لدراسة تأثير العزلات الميكروبية على فسيولوجيا المضيف. كما أنه يتألق باللون الأزرق عند الموت ، مما يوفر وسيلة ملائمة لتحديد الموت. تم استغلال هذه الخاصية لتطوير فحوصات بقاء C. elegans عالية الإنتاجية (LFASS). ويتضمن ذلك تسجيل مضان بفاصل زمني لمجموعات الديدان الموضوعة في صفائح متعددة الآبار ، والتي يمكن من خلالها اشتقاق متوسط وقت الوفاة. تعتمد الدراسة الحالية نهج LFASS لفحص عزلات ميكروبية متعددة في وقت واحد للتأثيرات على قابلية C. elegans للحرارة الشديدة والضغوط التأكسدية. يتم الإبلاغ هنا عن خط أنابيب الفحص الميكروبي هذا ، والذي يمكن استخدامه بشكل ملحوظ لفحص البروبيوتيك مسبقا ، باستخدام مقاومة الإجهاد الشديدة كبديل لصحة المضيف. يصف البروتوكول كيفية زراعة كل من مجموعات عزل ميكروبات الأمعاء C. elegans ومجموعات الديدان المتزامنة في صفائف متعددة الآبار قبل دمجها في المقايسات. يغطي المثال المقدم اختبار 47 عزلة بكتيرية وسلالة تحكم واحدة على سلالتين من الديدان ، في مقايستين للإجهاد بالتوازي. ومع ذلك ، فإن خط أنابيب النهج قابل للتطوير بسهولة وقابل للتطبيق على فحص العديد من الطرائق الأخرى. وبالتالي ، فإنه يوفر إعدادا متعدد الاستخدامات لإجراء مسح سريع للمناظر الطبيعية متعددة المعلمات للظروف البيولوجية والكيميائية الحيوية التي تؤثر على صحة C. elegans.
يحتوي جسم الإنسان على ما يقدر بنحو 10-100 تريليون خلية ميكروبية حية (البكتيريا والفطريات القديمة) ، والتي توجد بشكل أساسي في الأمعاء والجلد والبيئات المخاطية1. في حالة صحية ، توفر هذه الفوائد لمضيفها ، بما في ذلك إنتاج الفيتامينات ، ونضج الجهاز المناعي ، وتحفيز الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية لمسببات الأمراض ، وتنظيم التمثيل الغذائي للدهون ، وتعديل استجابات الإجهاد ، وأكثر من ذلك ، مع التأثير على النمو والتطور ، وظهور المرض ، والشيخوخة2،3،4،5 . تتطور ميكروبات الأمعاء أيضا بشكل كبير طوال الحياة. يحدث التطور الأكثر جذرية خلال مرحلة الرضاعة والطفولة المبكرة6 ، ولكن تحدث تغييرات كبيرة أيضا مع تقدم العمر ، بما في ذلك انخفاض في وفرة Bifidobacterium وزيادة في Clostridium و Lactobacillus و Enterobacteriaceae و Enterococcus الأنواع 7. يمكن أن يؤدي نمط الحياة إلى تغيير تكوين ميكروبات الأمعاء مما يؤدي إلى dysbiosis (فقدان البكتيريا المفيدة ، فرط نمو البكتيريا الانتهازية) ، مما يؤدي إلى أمراض مختلفة مثل مرض التهاب الأمعاء والسكري والسمنة5 ، ولكن أيضا المساهمة في مرض الزهايمر وأمراض باركنسون8،9،10،11.
ساهم هذا الإدراك بشكل حاسم في تحسين مفهوم محور الأمعاء والدماغ (GBA) ، حيث تعتبر التفاعلات بين فسيولوجيا الأمعاء (بما في ذلك الآن الميكروبات الموجودة داخلها) والجهاز العصبي المنظم الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي للحيوان والوظائف الفسيولوجية12. ومع ذلك ، فإن الدور الدقيق للميكروبات في إشارات الأمعاء والدماغ وآليات العمل المرتبطة بها بعيدة كل البعد عن الفهم الكامل13. مع كون ميكروبيوتا الأمعاء محددا رئيسيا للشيخوخة الصحية ، أصبحت كيفية تعديل البكتيريا لعملية الشيخوخة موضوعا للبحث المكثف والجدل6،14،15.
مع إثبات أن الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans تستضيف ميكروبيوتا الأمعاء الصادقة التي تهيمن عليها – كما هو الحال في الأنواع الأخرى – من قبل Bacteroidetes و Firmicutes و Actinobacteria16،17،18،19،20 ، صعودها السريع كمنصة تجريبية لدراسة التفاعلات المشتركة بين المضيفوالأمعاء 21،22،23،24 ، 25،26 وسعت بشكل كبير ترسانة التحقيقلدينا 26،27،28،29. على وجه الخصوص ، يمكن تكييف الأساليب التجريبية عالية الإنتاجية المتاحة ل C. elegans لدراسة النظام الغذائي الجيني ، والتفاعلات الجينية الدوائية ، والممرض الجيني ، وما إلى ذلك ، لاستكشاف كيفية تأثير العزلات البكتيرية والكوكتيلات على صحة C. elegans وشيخوختها بسرعة.
يصف البروتوكول الحالي خط أنابيب تجريبي لفحص صفائف من العزلات البكتيرية أو المخاليط الموضوعة في ألواح متعددة الآبار للتأثيرات على مقاومة الإجهاد C. elegans كبديل للصحة ، والتي يمكن استخدامها لتحديد البروبيوتيك. يوضح بالتفصيل كيفية تنمية أعداد كبيرة من الديدان والتعامل مع المصفوفات البكتيرية في تنسيقات ألواح 96 و 384 بئرا قبل معالجة الديدان لتحليل مقاومة الإجهاد الآلي باستخدام قارئ لوحة مضان (الشكل 1). يعتمد هذا النهج على فحوصات البقاء الآلية الخالية من الملصقات (LFASS)30 التي تستغل ظاهرة مضان الموت31 ، حيث تنتج الديدان المحتضرة دفعة من التألق الأزرق الذي يمكن استخدامه لتحديد وقت الوفاة. ينبعث التألق الأزرق بواسطة استرات الجلوكوزيل لحمض الأنثرانيليك المخزن في حبيبات الأمعاء C. elegans (نوع من العضيات المرتبطة بالليزوزوم) ، والتي تنفجر عندما يتم تشغيل شلال في أمعاء الدودة عند الوفاة31.
الشكل 1: سير العمل التجريبي للفحص عالي الإنتاجية للعزلات البكتيرية مع التأثير على مقاومة C. elegans للإجهاد . (أ) الجدول الزمني لصيانة الديدان والبكتيريا وإعداد المقايسة. (ب) إعداد صفيف صفيحة بكتيرية 96 بئرا والتعامل معها. (ج) إعداد لوحة دودة 384 بئرا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تقدم C. elegans العديد من المزايا للفحص السريع للمعلمات التجريبية المتعددة في وقت واحد ، نظرا لصغر حجمها وشفافيتها وتطورها السريع وعمرها القصير وعدم تكلفتها وسهولة التعامل معها. إن الجينوم الأبسط إلى حد كبير ، وخطة الجسم ، والجهاز العصبي ، والأمعاء ، والميكروبيوم ، ولكنه معقد ومشابه بما …
The authors have nothing to disclose.
نشكر CGC Minnesota (ماديسون ، الولايات المتحدة الأمريكية ، NIH – P40 OD010440) لتوفير سلالات دودة و OP50 و Pr. Hinrich Schulenburg (CAU ، كيل ، ألمانيا) لتوفير جميع العزلات الميكروبية البيئية الموضحة هنا. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة UKRI-BBSRC إلى AB (BB / S017127 / 1). يتم تمويل JM من خلال منحة دكتوراه FHM بجامعة لانكستر.
10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
Bleach | Honeywell | 425044 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB agar | Difco | 240110 | |
LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
Plate reader- Spark | Tecan | ||
Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |