केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस स्वास्थ्य पर प्रभाव के साथ माइक्रोबियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग
Summary
आंत के रोगाणु विशिष्ट या संरक्षित तंत्र के माध्यम से अपने मेजबान के स्वास्थ्य को सकारात्मक या नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। केनोरहाब्डिस एलिगेंस ऐसे रोगाणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक सुविधाजनक मंच है। वर्तमान प्रोटोकॉल नेमाटोड तनाव प्रतिरोध पर प्रभाव के लिए 48 बैक्टीरियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग का वर्णन करता है, जिसका उपयोग कृमि स्वास्थ्य के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जाता है।
Abstract
अपने छोटे आकार, छोटे जीवनकाल और आसान आनुवंशिकी के साथ, केनोरहाबिटिस एलिगेंस मेजबान शरीर विज्ञान पर माइक्रोबियल आइसोलेट्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मंच प्रदान करता है। यह मरने पर नीले रंग में भी फूलता है, जो मृत्यु को इंगित करने का एक सुविधाजनक साधन प्रदान करता है। इस गुण का उपयोग उच्च-थ्रूपुट लेबल-फ्री सी एलिगेंस सर्वाइवल एसेस (एलएफएएसएस) विकसित करने के लिए किया गया है। इनमें मल्टीवेल प्लेटों में स्थापित कृमि आबादी की टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस रिकॉर्डिंग शामिल है, जिससे मृत्यु का जनसंख्या औसत समय प्राप्त किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन गंभीर गर्मी और ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए सी एलिगेंस संवेदनशीलता पर प्रभाव के लिए एक बार में कई माइक्रोबियल आइसोलेट्स को स्क्रीन करने के लिए एलएफएएसएस दृष्टिकोण को अपनाता है। इस तरह की माइक्रोबियल स्क्रीनिंग पाइपलाइन, जिसका उपयोग विशेष रूप से प्रोबायोटिक्स को प्रीस्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, मेजबान स्वास्थ्य के लिए प्रॉक्सी के रूप में गंभीर तनाव प्रतिरोध का उपयोग करके यहां बताया गया है। प्रोटोकॉल बताता है कि सी एलिगेंस आंत माइक्रोबायोटा दोनों को मल्टीवेल सरणियों में अलग-अलग संग्रह और तुल्यकालिक कृमि आबादी को कैसे विकसित किया जाए, इससे पहले कि उन्हें परख के लिए संयोजित किया जाए। प्रदान किए गए उदाहरण में 47 बैक्टीरियल आइसोलेट्स के परीक्षण और दो कृमि उपभेदों पर एक नियंत्रण तनाव शामिल है, समानांतर में दो तनाव परखों में। हालांकि, दृष्टिकोण पाइपलाइन आसानी से स्केलेबल है और कई अन्य तौर-तरीकों की स्क्रीनिंग के लिए लागू है। इस प्रकार, यह जैविक और जैव रासायनिक स्थितियों के एक बहुपैरामीट्रिक परिदृश्य का तेजी से सर्वेक्षण करने के लिए एक बहुमुखी सेटअप प्रदान करता है जो सी एलिगेंस स्वास्थ्य को प्रभावित करता है ।
Introduction
मानव शरीर अनुमानित 10-100 ट्रिलियन जीवित माइक्रोबियल कोशिकाओं (बैक्टीरिया, आर्किया कवक) को आश्रय देता है, जो मुख्य रूप से आंत, त्वचा और श्लैष्मिकवातावरण में पाए जाते हैं। एक स्वस्थ अवस्था में, ये अपने मेजबान को लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें विटामिन उत्पादन, प्रतिरक्षा प्रणाली की परिपक्वता, रोगजनकों के लिए जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना, वसा चयापचय का विनियमन, तनाव प्रतिक्रियाओं का मॉड्यूलेशन, और बहुत कुछ, विकास और विकास, रोग की शुरुआत और उम्र बढ़ने पर प्रभाव पड़ता है। . आंत माइक्रोबायोटा भी पूरे जीवन में काफी विकसित होता है। सबसे कठोर विकास शैशवावस्था और प्रारंभिक बचपन6 के दौरान होता है, लेकिन उम्र के साथ महत्वपूर्ण परिवर्तन भी होते हैं, जिसमें बिफीडोबैक्टीरियम बहुतायत में कमी और क्लोस्ट्रीडियम, लैक्टोबैसिलस, एंटरोबैक्टीरिया और एंटरोकोकस प्रजातियों में वृद्धि शामिलहै। जीवनशैली आंत माइक्रोबियल संरचना को और बदल सकती है जिससे डिस्बिओसिस (लाभकारी बैक्टीरिया का नुकसान, अवसरवादी बैक्टीरिया का अतिवृद्धि) हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सूजन आंत्र रोग, मधुमेह और मोटापा5 जैसे विभिन्न विकृति हो सकती है, लेकिन अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग 8,9,10,11 में भी योगदान देती है।
इस अहसास ने आंत-मस्तिष्क अक्ष (जीबीए) की अवधारणा को परिष्कृत करने में गंभीर रूप से योगदान दिया है, जहां आंत शरीर विज्ञान (अब इसके भीतर रोगाणुओं सहित) और तंत्रिका तंत्र के बीच बातचीत को पशु चयापचय औरशारीरिक कार्यों का मुख्य नियामक माना जाता है। हालांकि, आंत-मस्तिष्क सिग्नलिंग में माइक्रोबायोटा की सटीक भूमिका और कार्रवाई के संबंधित तंत्र पूरी तरहसे समझ में आने से बहुत दूर हैं। आंत माइक्रोबायोटा स्वस्थ उम्र बढ़ने का एक प्रमुख निर्धारक होने के साथ, बैक्टीरिया उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को कैसे संशोधित करते हैं, यह गहन शोध और विवाद का विषय बन गया है 6,14,15.
इस प्रदर्शन के साथ कि राउंडवर्म केनोरहाब्डिस एलिगेंस एक बोनाफाइड आंत माइक्रोबायोटा का प्रभुत्व रखता है – जैसा कि अन्य प्रजातियों में – बैक्टेरोइड्स, फर्मिक्यूट्स और एक्टिनोबैक्टीरिया16,17,18,19,20 द्वारा, मेजबान-आंत कॉमेंसल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में इसकी तेजी से वृद्धि 21,22,23,24 25,26 ने हमारे जांच शस्त्रागारको 26,27,28,29 में काफी विस्तारित किया है। विशेष रूप से, जीन-आहार, जीन-दवा, जीन-रोगज़नक़, आदि इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए सी एलिगेंस के लिए उपलब्ध उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, तेजी से यह पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि बैक्टीरियल आइसोलेट्स और कॉकटेल सी एलिगेंस के स्वास्थ्य और उम्र बढ़ने को कैसे प्रभावित करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल स्वास्थ्य के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सी एलिगेंस तनाव प्रतिरोध पर प्रभाव के लिए मल्टीवेल प्लेटों में सेट बैक्टीरियल आइसोलेट्स या मिश्रण के एक बार में स्क्रीन करने के लिए एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन करता है, जिसका उपयोग प्रोबायोटिक्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। यह विवरण देता है कि प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर (चित्रा 1) का उपयोग करके स्वचालित तनाव प्रतिरोध विश्लेषण के लिए कीड़े को संसाधित करने से पहले 96- और 384-वेल प्लेट प्रारूपों में बड़ी कृमि आबादी को कैसे विकसित किया जाए और जीवाणु सरणियों को कैसे संभाला जाए। यह दृष्टिकोण लेबल-मुक्त स्वचालित उत्तरजीविता परख (एलएफएएसएस) 30 पर आधारित है जो मृत्यु प्रतिदीप्ति31 की घटना का फायदा उठाता है, जिससे मरने वाले कीड़े नीले प्रतिदीप्ति का एक विस्फोट पैदा करते हैं जिसका उपयोग मृत्यु के समय को इंगित करने के लिए किया जा सकता है। नीली प्रतिदीप्ति सी एलिगेंस आंत कणिकाओं (एक प्रकार का लाइसोसोम-संबंधित अंग) में संग्रहीत एंथ्रेनिलिक एसिड के ग्लूकोसिल एस्टर द्वारा उत्सर्जित होती है, जो मृत्यु पर कृमि आंत में एक नेक्रोटिक कैस्केड ट्रिगर होने पर फटजाती है।
चित्रा 1: तनाव के लिए सी एलिगेंस प्रतिरोध पर प्रभाव के साथ बैक्टीरियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए प्रायोगिक वर्कफ़्लो। (ए) कृमि और जीवाणु रखरखाव और परख सेटअप के लिए समयरेखा। (बी) 96-वेल बैक्टीरियल प्लेट सरणी सेटअप और हैंडलिंग। (सी) 384-वेल वर्म प्लेट सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलिगेंस अपने छोटे आकार, पारदर्शिता, तेजी से विकास, छोटे जीवनकाल, सस्तीता और हैंडलिंग में आसानी के कारण एक साथ कई प्रयोगात्मक मापदंडों की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए कई फायदे प्रदान करता है। इसका काफी ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सीजीसी मिनेसोटा (मैडिसन, यूएसए, एनआईएच – पी 40 ओडी 010440) को कृमि उपभेदों को प्रदान करने के लिए और ओपी 50 और पीआर हिनरिच शूलेनबर्ग (सीएयू, कील, जर्मनी) को यहां चित्रित सभी पर्यावरणीय माइक्रोबियल आइसोलेट्स प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एबी (बीबी / एस 017127/1) को यूकेआरआई-बीबीएसआरसी अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेएम को लैंकेस्टर विश्वविद्यालय एफएचएम पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Materials
| 10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
| 15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
| 384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
| 6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
| 96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB agar | Difco | 240110 | |
| LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
| LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
| LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
| Plate reader- Spark | Tecan | ||
| Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
| t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |
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