High-Throughput Screening av mikrobielle isolater med innvirkning på Caenorhabditis elegans Helse

Summary

Tarmmikrober kan positivt eller negativt påvirke helsen til verten via spesifikke eller konserverte mekanismer. Caenorhabditis elegans er en praktisk plattform for å skjerme for slike mikrober. Denne protokollen beskriver høy gjennomstrømningsscreening av 48 bakterielle isolater for påvirkning på nematodestressresistens, brukt som proxy for ormhelse.

Abstract

Med sin lille størrelse, korte levetid og enkle genetikk, tilbyr Caenorhabditis elegans en praktisk plattform for å studere virkningen av mikrobielle isolater på vertsfysiologi. Det fluorescerer også i blått når du dør, og gir et praktisk middel til å finne døden. Denne egenskapen har blitt utnyttet til å utvikle high-throughput etikettfrie C. elegans overlevelsesanalyser (LFASS). Disse involverer time-lapse fluorescensregistrering av ormpopulasjoner satt i multiwellplater, hvorfra befolkningens median dødstid kan utledes. Denne studien vedtar LFASS-tilnærmingen for å skjerme flere mikrobielle isolater samtidig for effektene på C. elegans følsomhet for alvorlig varme og oksidativ stress. Slike mikrobielle screening rørledning, som spesielt kan brukes til å prescreen probiotika, ved hjelp av alvorlig stressmotstand som en proxy for vertshelse, er rapportert her. Protokollen beskriver hvordan man dyrker både C. elegans tarmmikrobiota-isolatsamlinger og synkrone ormpopulasjoner i multiwell-arrays før de kombineres for analysene. Eksemplet som er gitt dekker testing av 47 bakterieisolater og en kontrollstamme på to ormstammer, i to stressanalyser parallelt. Innflygingsrørledningen er imidlertid lett skalerbar og anvendelig for screening av mange andre modaliteter. Dermed gir det et allsidig oppsett for raskt å kartlegge et multiparametrisk landskap av biologiske og biokjemiske forhold som påvirker C. elegans helse.

Introduction

Menneskekroppen har anslagsvis 10-100 billioner levende mikrobielle celler (bakterier, archaea sopp), som primært finnes i tarm-, hud- og slimhinnemiljøer1. I en sunn tilstand gir disse fordeler for verten, inkludert vitaminproduksjon, modning av immunsystemet, stimulering av medfødte og adaptive immunresponser mot patogener, regulering av fettmetabolismen, modulering av stressresponser og mer, med innvirkning på vekst og utvikling, sykdomsutbrudd og aldring 2,3,4,5 . Tarmmikrobiotaen utvikler seg også betydelig gjennom livet. Den mest drastiske utviklingen skjer i barndom og tidlig barndom⁶, men signifikante endringer forekommer også med alderen, inkludert en reduksjon i Bifidobacterium overflod og en økning i Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae og Enterococcus arter⁷. Livsstil kan ytterligere endre tarmens mikrobielle sammensetning som fører til dysbiose (tap av gunstige bakterier, overvekst av opportunistiske bakterier), noe som resulterer i ulike patologier som inflammatorisk tarmsykdom, diabetes og fedme⁵, men bidrar også til Alzheimers og Parkinsons sykdommer 8,9,10,11.

Denne erkjennelsen har kritisk bidratt til å raffinere begrepet tarm-hjerneaksen (GBA), hvor interaksjoner mellom tarmfysiologi (nå inkludert mikrober i den) og nervesystemet regnes som hovedregulator for dyremetabolisme og fysiologiske funksjoner¹². Imidlertid er den nøyaktige rollen som mikrobiota i tarm-hjernesignalering og tilhørende virkningsmekanismer langt fra å bli fullt ut forstått¹³. Med tarmmikrobiota som en viktig determinant for sunn aldring, har hvordan bakterier modulerer aldringsprosessen blitt gjenstand for intens forskning og kontrovers 6,14,15.

Med demonstrasjonen at rundorm Caenorhabditis elegans er vert for en bonafide tarmmikrobiota dominert – som i andre arter – av Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria 16,17,18,19,20, den raske økningen som en eksperimentell plattform for å studere host-gut commensal interaksjoner 21,22,23,24 ,^25,26 har betydelig utvidet vårt etterforskningsarsenal^26,27,28,29. Spesielt kan eksperimentelle tilnærminger med høy gjennomstrømning som er tilgjengelige for C. elegans for å studere gen-diett, gen-stoff, genpatogen, etc. interaksjoner, tilpasses for raskt å undersøke hvordan bakterielle isolater og cocktailer påvirker C. elegans helse og aldring.

Den nåværende protokollen beskriver en eksperimentell rørledning for å skjerme samtidig arrays av bakterielle isolater eller blandinger satt i multiwell plater for effekter på C. elegans stressmotstand som en proxy for helse, som kan brukes til å identifisere probiotika. Den beskriver hvordan man kan vokse store ormpopulasjoner og håndtere bakterielle arrays i 96- og 384-brønns plateformater før behandling av ormer for automatisert stressmotstandsanalyse ved hjelp av en fluorescensplateleser (figur 1). Tilnærmingen er basert på etikettfrie automatiserte overlevelsesanalyser (LFASS)³⁰ som utnytter fenomenet dødsfluorescens³¹, der døende ormer produserer et utbrudd av blå fluorescens som kan brukes til å fastslå dødstidspunktet. Blå fluorescens sendes ut av glukosylestere av anthranilinsyre lagret i C. elegans tarmgranulat (en type lysosomrelatert organell), som brister når en nekrotisk kaskade utløses i ormtarmen ved døden³¹.

Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt for høy gjennomstrømningsscreening av bakterieisolater med innvirkning på C. elegans motstand mot stress . (A) Tidslinje for vedlikehold og analyse av ormer og bakterier. (B) 96-brønn bakteriell plate array oppsett og håndtering. (C) 384-brønns ormplateoppsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

De to C. elegans-stammene som ble brukt parallelt for den nåværende studien var Bristol N2 villtype og HT1890: daf-16 (mgDf50), som vokser med tilsvarende hastigheter. Protokollen kan imidlertid replikeres med en hvilken som helst kombinasjon av to stammer som har lignende vekstrater. Merk at når du tester andre stammer parallelt (for eksempel villtype og sakte voksende daf-2-mutanter ), må forskjellige vekstrater vurderes, og følgelig må protokollen justeres. Tidsskalaene og mengdene av …

Representative Results

LFASS-analyser gir robust, høy gjennomstrømning og rask screening av flere testforhold samtidig, for eksempel screening av mange genetiske og mikrobiotaparametere som bidrar til stressmotstand og aldring. Det tar bare 2-3 uker for eksperimentet å skaffe seg et omfattende datasett med flere testforhold. L4 + 36 h voksne villtype ormpopulasjoner ble utsatt for 42 ° C termisk stress og 7% t-BHP-indusert oksidativt stress etter en 36 timers kultur på 48 tarmmikrobielle isolater i 36 timer. Analysen ble utført…

Discussion

C. elegans tilbyr mange fordeler for rask screening av flere eksperimentelle parametere samtidig, på grunn av sin lille størrelse, gjennomsiktighet, rask utvikling, kort levetid, billighet og enkel håndtering. Dens betydelig enklere genom, kroppsplan, nervesystem, tarm og mikrobiom, men likevel kompleks og lik nok til mennesker, gjør det til en kraftig preklinisk modell, hvor mekanistisk innsikt kan oppnås under testing for bioaktiv effekt eller toksisitet. Ettersom interessen vokser for å utvikle mikrobie…

Materials

10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422