Tarmmikrober kan positivt eller negativt påverka värdens hälsa via specifika eller konserverade mekanismer. Caenorhabditis elegans är en bekväm plattform för att screena för sådana mikrober. Detta protokoll beskriver screening med hög genomströmning av 48 bakterieisolat för påverkan på nematodstressresistens, som används som en proxy för maskhälsa.
Med sin lilla storlek, korta livslängd och enkla genetik erbjuder Caenorhabditis elegans en bekväm plattform för att studera effekterna av mikrobiella isolat på värdfysiologin. Det fluorescerar också i blått när det dör, vilket ger ett bekvämt sätt att hitta döden. Denna egenskap har utnyttjats för att utveckla etikettfria C. elegans survival assays (LFASS) med hög genomströmning. Dessa involverar time-lapse fluorescensregistrering av maskpopulationer i multiwellplattor, från vilka populationens mediantid för döden kan härledas. Denna studie antar LFASS-metoden för att screena flera mikrobiella isolat samtidigt för effekterna på C. elegans mottaglighet för svår värme och oxidativa påfrestningar. Sådan mikrobiell screening pipeline, som särskilt kan användas för att prescreena probiotika, med hjälp av svår stressresistens som en proxy för värd hälsa rapporteras här. Protokollet beskriver hur man odlar både C. elegans tarmmikrobiota-isolatsamlingar och synkrona maskpopulationer i multiwell-arrays innan de kombineras för analyserna. Exemplet som tillhandahålls omfattar testning av 47 bakterieisolat och en kontrollstam på två maskstammar, i två stressanalyser parallellt. Tillvägagångssättspipelinen är dock lätt skalbar och tillämplig på screening av många andra metoder. Således ger det en mångsidig inställning för att snabbt kartlägga ett multiparametriskt landskap av biologiska och biokemiska förhållanden som påverkar C. elegans hälsa.
Människokroppen har uppskattningsvis 10-100 biljoner levande mikrobiella celler (bakterier, archaea-svampar), som främst finns i tarm-, hud- och slemhinnemiljöerna1. I ett hälsosamt tillstånd ger dessa fördelar för sin värd, inklusive vitaminproduktion, mognad av immunsystemet, stimulering av medfödda och adaptiva immunsvar mot patogener, reglering av fettmetabolism, modulering av stressreaktioner och mer, med inverkan på tillväxt och utveckling, sjukdomsdebut och åldrande 2,3,4,5 . Tarmmikrobiotan utvecklas också avsevärt under hela livet. Den mest drastiska utvecklingen sker under spädbarn och tidig barndom6, men betydande förändringar sker också med åldern, inklusive en minskning av Bifidobacterium överflöd och en ökning av Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae, och Enterococcus arter7. Livsstil kan ytterligare förändra tarmens mikrobiella sammansättning som leder till dysbios (förlust av fördelaktiga bakterier, överväxt av opportunistiska bakterier), vilket resulterar i olika patologier som inflammatorisk tarmsjukdom, diabetes och fetma5, men också bidrar till Alzheimers och Parkinsons sjukdomar 8,9,10,11.
Denna insikt har kritiskt bidragit till att förfina begreppet tarm-hjärnaxeln (GBA), där interaktioner mellan tarmfysiologi (nu inklusive mikroberna i den) och nervsystemet anses vara den viktigaste regulatorn för djurmetabolism och fysiologiska funktioner12. Emellertid, den exakta rollen av mikrobiota i tarm-hjärna signalering och de associerade verkningsmekanismerna är långt ifrån helt förstådd13. Med tarmmikrobiota som en viktig determinant för hälsosamt åldrande har hur bakterier modulerar åldringsprocessen blivit föremål för intensiv forskning och kontrovers 6,14,15.
Med demonstrationen att rundmask Caenorhabditis elegans är värd för en bonafide tarmmikrobiota dominerad-som i andra arter-av Bacteroidetes, Firmicutes och Actinobacteria 16,17,18,19,20, dess snabba uppgång som en experimentell plattform för att studera värd-tarm kommensala interaktioner 21,22,23,24 ,25,26 har avsevärt utökat vår utredningsarsenal26,27,28,29. I synnerhet kan experimentella metoder med hög genomströmning tillgängliga för C. elegans för att studera gen-diet, gen-läkemedel, gen-patogen, etc. interaktioner, anpassas för att snabbt utforska hur bakterieisolat och cocktails påverkar C. elegans hälsa och åldrande.
Detta protokoll beskriver en experimentell pipeline för att på en gång screena arrays av bakterieisolat eller blandningar som sätts i multiwell plattor för effekter på C. elegans stressresistens som en proxy för hälsa, som kan användas för att identifiera probiotika. Den beskriver hur man odlar stora maskpopulationer och hanterar bakteriella arrayer i 96- och 384-brunnsplattformat innan man bearbetar maskar för automatiserad stressmotståndsanalys med hjälp av en fluorescensplattläsare (figur 1). Tillvägagångssättet bygger på etikettfria automatiserade överlevnadsanalyser (LFASS)30 som utnyttjar fenomenet dödsfluorescens31, där döende maskar producerar en explosion av blå fluorescens som kan användas för att fastställa dödstiden. Blå fluorescens avges av glukosylestrar av anthranilsyra lagrade i C. elegans tarmgranulat (en typ av lysosomrelaterad organell), som spricker när en nekrotisk kaskad utlöses i masktarmen vid döden31.
Figur 1: Experimentellt arbetsflöde för screening med hög genomströmning av bakterieisolat med inverkan på C. elegans motståndskraft mot stress . (A) Tidslinje för underhåll och analys av mask och bakterier. (B) Installation och hantering av bakterieplattor med 96 brunnar. (C) Installation av maskplattor med 384 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
C. elegans erbjuder många fördelar för att snabbt screena flera experimentella parametrar samtidigt, på grund av dess lilla storlek, transparens, snabba utveckling, korta livslängd, billighet och enkel hantering. Dess betydligt enklare genom, kroppsplan, nervsystem, tarm och mikrobiom, men ändå komplexa och tillräckligt lika människor, gör det till en kraftfull preklinisk modell, där mekanistisk insikt kan uppnås när man testar för bioaktiv effekt eller toxicitet. Eftersom intresset växer för att…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar CGC Minnesota (Madison, USA, NIH – P40 OD010440) för att tillhandahålla maskstammar och OP50 och Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Tyskland) för att tillhandahålla alla miljömikrobiella isolat som visas här. Detta arbete finansierades av ett UKRI-BBSRC-bidrag till AB (BB/S017127/1). JM finansieras av ett doktorandstipendium från Lancaster University FHM.
10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
Bleach | Honeywell | 425044 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB agar | Difco | 240110 | |
LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
Plate reader- Spark | Tecan | ||
Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |