Выделение преадипоцитов из эмбрионов цыплят-бройлеров
Summary
Настоящий протокол описывает простой способ выделения преадипоцитов из жировой ткани у эмбрионов бройлеров. Этот метод позволяет выделить с высоким выходом, первичной культурой и адипогенной дифференцировкой преадипоцитов. Окрашивание маслом Red O и окрашивание липидов/ДНК измеряли адипогенную способность изолированных клеток, индуцированных дифференцировочными средами.
Abstract
Первичные преадипоциты являются ценной экспериментальной системой для понимания молекулярных путей, которые контролируют дифференцировку и метаболизм адипоцитов. Куриные эмбрионы дают возможность выделить преадипоциты с самой ранней стадии развития жировой ткани. Эта первичная клетка может быть использована для выявления факторов, влияющих на пролиферацию преадипоцитов и адипогенную дифференцировку, что делает их ценной моделью для исследований, связанных с детским ожирением и контролем избыточного отложения жира у домашней птицы. Быстрый рост постнатальной жировой ткани эффективно истощает корм, распределяя его вдали от роста мышц у цыплят-бройлеров. Таким образом, методы понимания самых ранних стадий развития жировой ткани могут дать подсказки для регулирования этой тенденции и определения способов ограничения расширения жировой ткани в раннем возрасте. Настоящее исследование было разработано для разработки эффективного метода выделения, первичной культуры и адипогенной дифференцировки преадипоцитов, выделенных из развивающейся жировой ткани коммерческих эмбрионов цыплят бройлеров (мясного типа). Процедура была оптимизирована для получения клеток с высокой жизнеспособностью (~ 98%) и повышенной способностью дифференцироваться в зрелые адипоциты. Этот простой метод выделения, культивирования и дифференцировки эмбриональных преадипоцитов поддерживает функциональный анализ роста и развития жиров в раннем возрасте.
Introduction
Ожирение является глобальной угрозой для здоровья как взрослых, так и детей. Дети с избыточным весом или ожирением примерно в пять раз чаще страдают ожирением во взрослом возрасте, что подвергает их значительно повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и многих других сопутствующих заболеваний. Около 13,4% американских детей в возрасте 2-5 лет имеют ожирение1, что свидетельствует о том, что тенденция накапливать избыток жира в организме может быть приведена в движение очень рано в жизни. По самым разным причинам накопление избыточной жировой ткани является проблемой для цыплят-бройлеров (мясного типа). Современные бройлеры невероятно эффективны, но все же накапливают больше липидов, чем физиологически необходимо 2,3. Эта тенденция начинается вскоре после вылупления и эффективно растрачивает корм, самый дорогой производственный компонент, выделяя его вдали от роста мышц. Поэтому как для детей, так и для цыплят-бройлеров, хотя и по самым разным причинам, необходимо понимать факторы, влияющие на развитие жировой ткани, и определять способы ограничения жирового расширения в раннем возрасте.
Адипоциты образуются из преадипоцитов, стволовых клеток, полученных из жировой ткани, которые подвергаются дифференцировке для развития зрелых, накапливающих липиды жировых клеток. Соответственно, преадипоциты in vitro являются ценной экспериментальной моделью для исследований ожирения. Эти клетки, выделенные из стромальной сосудистой фракции жировых депо, могут обеспечить фундаментальное понимание молекулярных путей, контролирующих дифференцировку и метаболизм адипоцитов 4,5. Эмбрионы цыплят являются благоприятной экспериментальной моделью в исследованиях развития, потому что культивирование яиц по желаемому графику облегчает экспериментальные манипуляции, поскольку позволяет получить эмбрионы без жертв матери для наблюдения за серией стадий развития эмбрионов. Кроме того, для получения эмбрионов по сравнению с более крупными моделями животных не требуются сложные хирургические процедуры и длительные периоды времени. Поэтому эмбрион цыпленка представляет возможность получения преадипоцитов с самых ранних стадий развития жировой ткани. Подкожная жировая клетчатка становится видимой у птенца около эмбрионального дня 12 (Е12) в виде четко очерченного депо, расположенного вокруг бедра. Это депо обогащено высокопролиферативными преадипоцитами, которые активно подвергаются дифференцировке под сигналами развития с образованием зрелых адипоцитов 6,7. Процесс адипогенной дифференциации сопоставим между курами и человеком. Поэтому преадипоциты, выделенные из эмбрионов цыплят, могут быть использованы в качестве модели двойного назначения для исследований, имеющих отношение к людям и домашней птице. Однако выход преадипоцитов снижается со старением, поскольку клетки вырастают в зрелые адипоциты5.
Настоящий протокол оптимизирует выделение преадипоцитов из жировой ткани на стадии (E16-E18), на которой адипогенная дифференцировка и гипертрофия адипоцитов находятся на пике у эмбрионов цыплят бройлеров8. Эта процедура может оценить влияние факторов, которым развивается эмбрион в ово, таких как диета курицы, на развитие адипоцитов и адипогенный потенциал ex vivo. Он также может проверить влияние различных манипуляций (например, гипоксии, питательных добавок, фармакологических агонистов и антагонистов) на адипогенез или различные «омы» (например, транскриптом, метаболом, метилом) предшественников адипоцитов. Как представление самой ранней стадии образования жиров, клетки, полученные с использованием этого протокола, являются ценными моделями для исследований, относящихся к домашней птице и человеку.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя в нескольких хорошо описанных протоколах сообщалось об выделении преадипоцитов 14,15,16,17, изоляция для эмбриональных преадипоцитов была оптимизирована, что может быть использовано для функционального анализа роста и развития жира в раннем возрасте у цыплят брой?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят UT AgResearch и Департамент наук о животных за поддержку и оптимизацию этого протокола. Эта работа финансировалась за счет гранта Министерства сельского хозяйства США.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
Referências
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
