Preadipositlerin Broiler Civciv Embriyolarından İzolasyonu
Summary
Bu protokol, piliç embriyolarında preadipositlerin yağ dokusundan izole edilmesi için basit bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek verim, primer kültür ve preadipositlerin adipojenik farklılaşması ile izolasyonu sağlar. Yağ Kırmızı O boyama ve lipid / DNA boyası, farklılaşma ortamı ile indüklenen izole hücrelerin adipojenik yeteneğini ölçtü.
Abstract
Primer preadipositler, adiposit farklılaşmasını ve metabolizmasını kontrol eden moleküler yolları anlamak için değerli bir deneysel sistemdir. Tavuk embriyoları, preadipositleri yağ gelişiminin en erken aşamasından izole etme fırsatı sağlar. Bu birincil hücre, preadiposit proliferasyonunu ve adipojenik farklılaşmayı etkileyen faktörleri tanımlamak için kullanılabilir, bu da onları çocukluk çağı obezitesi ve kümes hayvanlarında aşırı yağ birikiminin kontrolü ile ilgili çalışmalar için değerli bir model haline getirir. Doğum sonrası yağ dokusunun hızlı büyümesi, piliç tavuklarında kas büyümesinden uzaklaştırılarak yemi etkili bir şekilde boşa harcar. Bu nedenle, yağ dokusu gelişiminin en erken aşamalarını anlama yöntemleri, bu eğilimi düzenlemek ve yaşamın erken dönemlerinde yağ genişlemesini sınırlamanın yollarını belirlemek için ipuçları sağlayabilir. Bu çalışma, ticari piliç (et tipi) civciv embriyolarının yağ dokusunun gelişmesinden izole edilen preadipositlerin izolasyonu, primer kültürü ve adipojenik farklılaşması için etkili bir yöntem geliştirmek üzere tasarlanmıştır. Prosedür, yüksek canlılığa (~% 98) sahip hücreler üretmek ve olgun adipositlere farklılaşmak için artan kapasite sağlamak için optimize edilmiştir. Bu basit embriyonik preadiposit izolasyonu, kültürü ve farklılaşması yöntemi, erken yaşamda yağ büyümesi ve gelişiminin fonksiyonel analizlerini destekler.
Introduction
Obezite hem yetişkinler hem de çocuklar için küresel bir sağlık tehdididir. Aşırı kilolu veya obez olan çocukların yetişkinler gibi obez olma olasılığı yaklaşık beş kat daha fazladır ve bu da onları kardiyovasküler hastalık, diyabet ve diğer birçok komorbidite için önemli ölçüde artmış risk altına sokar. 2-5 yaş arası ABD’li çocukların yaklaşık% 13.4’ünde obezite1 vardır, bu da aşırı vücut yağı biriktirme eğiliminin yaşamın çok erken dönemlerinde harekete geçirilebileceğini göstermektedir. Çok farklı nedenlerden dolayı, aşırı yağ dokusunun birikmesi, piliç (et tipi) tavuklar için bir endişe kaynağıdır. Modern piliçler inanılmaz derecede verimlidir, ancak yine de fizyolojik olarak gerekli olandan daha fazla lipit biriktirir 2,3. Bu eğilim, yumurtadan çıktıktan kısa bir süre sonra başlar ve en pahalı üretim bileşeni olan yemi, kas büyümesinden uzaklaştırarak etkili bir şekilde boşa harcar. Bu nedenle, hem çocuklar hem de piliç tavukları için, çok farklı nedenlerle de olsa, yağ dokusu gelişimini etkileyen faktörleri anlamaya ve yaşamın erken dönemlerinde yağ genişlemesini sınırlamanın yollarını belirlemeye ihtiyaç vardır.
Adipositler, olgun, lipit depolayan yağ hücreleri geliştirmek için farklılaşmaya uğrayan preadipositlerden, yağ dokusundan türetilmiş kök hücrelerden oluşur. Bu doğrultuda preadipositler in vitro obezite çalışmaları için değerli bir deneysel modeldir. Yağ depolarının stromal vasküler fraksiyonundan izole edilen bu hücreler, adiposit farklılaşmasını ve metabolizmasını kontrol eden moleküler yolakların temel bir anlayışını sağlayabilir 4,5. Civciv embriyoları, gelişimsel çalışmalarda olumlu bir deneysel modeldir, çünkü yumurtaların istenen programda kültürlenmesi, embriyoların bir dizi gelişim aşamasını gözlemlemek için annenin fedakarlığı olmadan embriyo elde edilmesini sağladığı için deneysel manipülasyonu kolaylaştırır. Ayrıca, daha büyük hayvan modellerine göre embriyo elde etmek için karmaşık cerrahi prosedürler ve uzun süreler gerekli değildir. Bu nedenle, civciv embriyosu, yağ dokusu gelişiminin en erken aşamalarından preadiposit elde etmek için bir fırsat sunar. Subkutan yağ dokusu, embriyonik gün 12 (E12) civarında civcivde, uyluk çevresinde bulunan açıkça tanımlanmış bir depo olarak görünür hale gelir. Bu depo, olgun adipositler 6,7 oluşturmak için gelişimsel ipuçları altında aktif olarak farklılaşmaya uğrayan oldukça proliferatif preadipositler bakımından zenginleştirilmiştir. Adipojenik farklılaşma süreci tavuklar ve insanlar arasında karşılaştırılabilir. Bu nedenle, civciv embriyolarından izole edilen preadipositler, insanlar ve kümes hayvanları ile ilgili çalışmalar için çift amaçlı bir model olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, preadipositlerin verimi, hücreler olgun adipositlere dönüştükçe yaşlanmayla birlikte azalır5.
Mevcut protokol, piliç civciv embriyolarında adipojenik farklılaşma ve adiposit hipertrofisinin zirvede olduğu aşamada (E16-E18) preadipositlerin yağ dokusundan izolasyonunu optimize eder8. Bu prosedür, tavuk diyeti gibi gelişmekte olan embriyonun ovo’da maruz kaldığı faktörlerin adiposit gelişimi ve adipojenik potansiyel ex vivo üzerindeki etkilerini değerlendirebilir. Ayrıca, çeşitli manipülasyonların (örneğin, hipoksi, besin ilaveleri, farmakolojik agonistler ve antagonistler) adipogenez veya adiposit progenitörlerinin çeşitli ‘omes’leri (örneğin, transkriptom, metabolom, metilom) üzerindeki etkisini test edebilir. Yağ oluşumunun en erken aşamasının bir temsili olarak, bu protokol kullanılarak elde edilen hücreler, kümes hayvanları ve insanlarla ilgili çalışmalar için değerli modellerdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her ne kadar iyi tanımlanmış birkaç protokol preadipositlerin izolasyonunu bildirmiş olsa da14,15,16,17, embriyonik preadipositler için izolasyon optimize edilmiştir, bu da piliç civcivlerinde erken yaşam yağ büyümesi ve gelişiminin fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu protokol, yüksek diferansiyasyon potansiyeline sahip yüksek canlılık embriyonik adiposit progeni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokolü destekledikleri ve optimize ettikleri için UT AgResearch ve Hayvan Bilimi Bölümü’ne teşekkür eder. Bu çalışma USDA hibesi ile finanse edildi.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
Referências
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
