본 프로토콜은 민감한 분자 검출을 위해 플라즈몬 나노입자를 조작하기 위해 광학 트래핑 및 표면 강화 라만 분광법(SERS)을 통합하는 편리한 접근 방식을 설명합니다. 응집제 없이 트래핑 레이저는 플라즈몬 나노입자를 조립하여 현장 분광 측정을 위한 표적 분석물의 SERS 신호를 향상시킵니다.
표면 강화 라만 분광법(SERS)은 금속 나노구조의 향상된 전기장으로 인해 다양한 응용 분야에서 분석물 분자의 초고감도 검출을 가능하게 합니다. 염 유도은 나노 입자 응집은 SERS 활성 기질을 생성하는 가장 보편적 인 방법입니다. 그러나 재현성, 안정성 및 생체 적합성이 좋지 않아 제한됩니다. 본 프로토콜은 광학 조작과 SERS 검출을 통합하여 이를 해결하기 위한 효율적인 분석 플랫폼을 개발합니다. 1064nm 트래핑 레이저와 532nm 라만 프로브 레이저를 현미경으로 결합하여 은 나노입자를 조립하여 수성 환경에서 현장 SERS 측정을 위한 플라즈몬 핫스팟을 생성합니다. 응집제 없이, 이 동적 플라즈몬 은 나노입자 어셈블리는 분석물 분자 신호의 약 50배 향상을 가능하게 합니다. 또한 공간 및 시간 제어를 제공하여 0.05nM의 낮은 분석물 코팅된 은 나노입자 용액에서 SERS 활성 어셈블리를 형성하여 생체 내 분석을 위한 잠재적인 섭동을 최소화합니다. 따라서 이 광학 트래핑 통합 SERS 플랫폼은 액체, 특히 수성 생리학적 환경에서 효율적이고 재현 가능하며 안정적인 분자 분석을 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
표면 강화 라만 분광법(SERS)은 초저 농도 또는 단일 분자 수준 1,2,3,4에서 표적 분자의 화학 구조를 직접 검출하기 위한 민감한 분석 기술입니다. 레이저 조사는 표적 분자의 라만 신호를 증폭하기 위해 SERS 기질로 사용되는 금속 나노 구조에서 국부적 인 표면 플라즈몬 공명을 유도합니다. 염-유도된 나노입자 응집체는 널리 사용되는 SERS 기질이며, 이는 콜로이드 현탁액 5,6에서 자발적으로 브라운 운동을 겪는다. 추가 건조로 안정적인 SERS 측정이 가능합니다. 그러나, 불순물 농도가 발생할 수 있으며, 이는 배경 소음을 발생시키고생물학적 샘플에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킨다7. 따라서 무염 나노 입자 응집체를 개발하고 용액에서의 움직임을 제어하며 측정 효율성을 유지하면서 생체 적합성을 개선하는 것이 적절합니다.
광학 트래핑은 다양한 금속 기판을 제어하고 SERS 검출 8,9,10,11,12,13,14를 용이하게하기 위해 채택되었습니다. 광학 트랩은 레이저 빔을 단단히 집중시켜 광학 힘장을 생성함으로써 생성되며, 이는 초점(15,16) 주위의 가장 높은 강도 영역으로 작은 물체를 끌어당깁니다. 최근에, 광학 트랩은 다양한 응용 분야를위한 재현 가능하고 민감한 플라즈몬 감지 플랫폼을 개발하는 데 사용되어 용액 17,18,19,20,21,22,23,24에서 SERS 활성 금속 나노 구조의 위치를 찾고 제어하는 데있어 고유 한 이점을 보여줍니다. . 본 프로토콜은 광학 핀셋과 라만 분광-현미경을 결합하여 은 나노입자(AgNP)를 동적으로 조립하고 효율적인 SERS 측정을 위해 용액에서 브라운 운동에 대해 안정화하는 접근 방식을 도입합니다. AgNP 조립 영역에서, AgNP의 표면에 코팅 된 분석 물 분자 인 3,3′- 디티 오비스 [6- 니트로 벤조산] 비스 (숙신이 미드) 에스테르 (DSNB)의 신호는 약 50 배 향상 될 수있다. 이 접근법은 화학적 캡핑 제25,26,27과 호환되지 않는 민감한 생체 분자를 분석하는데 적합하다. 또한 SERS 활성 AgNP 어셈블리를 생성하기 위한 공간 및 시간 제어를 제공합니다. 이를 통해 수성 환경에서 현장 검출이 가능하여 AgNP의 사용량을 줄이고 생체 내 분석28,29,30의 섭동을 최소화할 수 있습니다. 또한, 광학 트래핑-유도된 AgNP 어셈블리는 안정하고, 재현가능하며, 가역적이다(31,32). 따라서 용액 및 염으로 인한 응집이 적용되지 않는 생리학적 조건에서 분석물 분자를 검출하기 위한 유망한 플랫폼입니다.
본 연구에서는 입자의 광학 조작 및 시각화를 위해 1064nm 트래핑 레이저, 힘 감지 모듈 및 명시야 조명 소스가 광학 핀셋 현미경 시스템에 통합됩니다. 532nm 라만 프로브 레이저도 현미경에 통합되어 샘플 챔버의 트래핑 레이저와 정렬되었습니다. 스펙트럼 획득을 위해 후방 산란광을 수집하여 분광계로 방향을 바꿨습니다(그림 1).
본 연구는 현장 분자 특성화를 위해 광학 트래핑과 SERS 검출을 결합한 분석 플랫폼을 보고합니다. 532nm 라만 프로브 빔을 스테레오 이중층 경로를 통해 1064nm 트래핑 레이저 빔과 결합하여 후방 산란 형상에서 추가 분광 측정을 위해 초점을 결합하고 수집했습니다. 트래핑 레이저 빔은 AgNP를 조립하여 플라즈몬 핫스팟을 형성한 다음 라만 프로브 레이저 빔을 여기시켜 용액 내 분석물 분자의 SERS 신호를 생성합니다. 개념 증명으로 DSNB의 검출이 시연되었으며, 이는 AgNP의 표면에 코팅되었습니다. 트래핑 레이저 빔에 의해 제어되는 AgNP 어셈블리 영역에서, 주변의 분산된 AgNPs에 비해 DSNB의 신호가 약 50배 향상되었다. 제시된 플랫폼 상의 용액상 SERS 측정에서 분석물 분자의 유사한 고신호 증폭이 재현 가능하게 얻어졌다.
SERS 신호 증폭에 영향을 미치는 중요한 단계는 광학 트래핑 유도 AgNP 어셈블리를 형성하는 것입니다. 분석물 분자의 SERS 신호는 트래핑 레이저 출력, 조사 시간 및 AgNP 농도와 같은 실험 파라미터를 미세 조정하여 최적화할 수 있습니다. 도 8에 도시된 바와 같이, 더 높은 트래핑 레이저 파워를 사용하면 AgNP 어셈블리 형성의 효율을 높일 수 있다. 재현 가능한 AgNP 어셈블리는 트래핑 레이저의 출력을 450mW에서 700mW로 증가시켜 얻었습니다. 그러나, 950 mW보다 높은 트래핑 레이저 출력은 과열 및 버블 생성을 유도할 수 있다(38). 따라서 동적 AgNP 어셈블리를 만들기 위해 적당한 트래핑 레이저 출력이 권장됩니다. 유사하게, 더 긴 조사 시간은 AgNP 어셈블리의 형성을 촉진하는 데 유용합니다. 도 8B 는 조사 시간이 5-20초에서 증가하였을 때 투명한 구형 AgNP 조립체가 형성되었음을 보여준다. 그러나, AgNP 어셈블리는 60 초 조사 후에 왜곡되었다. 또한, AgNP 어셈블리의 형성은 도 8C에 도시된 바와 같이, 0.25nM에서 빠르게 과열된 반면, 0.01nM에서 0.05nM로 더 높은 AgNP 농도에서 가속화되었다. 명백한 AgNP 어셈블리 형성이 없는 경우 트래핑 레이저 출력과 조사 시간을 늘리는 것이 좋습니다. 안정적인 AgNP 어셈블리가 생성되면 잠재적인 열 손상을 방지하기 위해 트래핑 레이저를 낮추어야 합니다.
광학 트래핑-유도된 AgNP 어셈블리의 SERS 활성은 도 6B에서 다크 스팟인 트래핑 레이저 조사 영역에서의 국소 AgNP 농도의 증가에 기인하였다. 유체 AgNP 용액에서 광학 트랩은 AgNP를 지속적으로 끌어 당겨 입자 간 접합의 제한된 공간에 플라즈몬 핫스팟을 축적하고 형성 할 수 있습니다. 이것은 SERS 효과를 향상시키는 향상된 전기장을 생성합니다. 도 6E에 도시된 바와 같이, 트래핑 레이저 없이 더 낮은 AgNP 농도(0.05nM)에서 획득된 약한 SERS 신호와 비교하여 더 높은 AgNP 농도(1.00nM)에서 얻어진 더 강한 SERS 신호에 의해 추가로 검증되었다.
또한, 광학 트래핑에 의한 브라운 운동에 대한 용액 내 플라즈몬 AgNP 어셈블리의 위치 제어는 SERS 측정의 효율성과 안정성을 크게 향상 시켰습니다. 고처리량 감지는 미세유체 시스템에 연결될 때 수행될 수 있습니다. SERS 활성 기질을 생성하기 위해 나노 입자의 전통적인 염 유도 응집과 비교할 때, 당사의 플랫폼은 설계된 위치와 순간에서 높은 유연성26,28로 플라즈몬 AgNP 어셈블리의 동적 형성을 허용합니다. 또한 나노몰 AgNP 농도에서 효율적으로 작동하며 용액의 현장 분광 측정을 위해 SERS 활성 핫스팟의 공간-시간 조작을 가능하게 합니다. 이 동적 AgNP 어셈블리는 트래핑 레이저가 꺼지면 몇 분 안에 점차적으로 분해됩니다. 트래핑 레이저가 없으면 추가 그림 1과 같이 AgNP 어셈블리가 20분 만에 거의 사라졌습니다. 이는 검출 시스템에 미치는 영향을 최소화할 수 있으며 다양한 생체 응용 분야, 특히 생리학적 및 생체 내 조건에서 생체 분자(DNA, RNA 및 단백질)의 검출에 큰 잠재력을 나타냅니다. 그러나, 이러한 동적 AgNP 어셈블리는 염-유도된 AgNP 응집체2보다 더 작은 강화 인자를 제공하므로, 추가의 변형 및 개발이 요구된다.
결론적으로, 광학 트래핑과 SERS 검출의 통합은 플라즈몬 나노입자를 제어하고 재현 가능한 SERS 신호 향상을 달성하여 고효율, 안정성 및 생체 적합성을 가진 용액에서 분석물 분자를 검출하는 편리한 방법을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 심천시 과학기술혁신위원회의 자금 지원을 인정합니다(No. JCYJ20180306174930894), 중산시 과학 기술국 (2020AG003) 및 홍콩 연구 보조금위원회 (프로젝트 26303018). 우리는 또한 Chi-Ming Che 교수와 중화 인민 공화국 홍콩 특별 행정구 정부 혁신 기술위원회가 시작한 Health@InnoHK 프로그램에 따라 “합성 화학 및 화학 생물학 실험실”의 자금 지원을 인정합니다.
1064 nm trapping laser | IPG Photonics, United States | 1064 nm CW Yb fiber laser, 10W | ||
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester | Biosynth Carbosynth | FD15467 | ||
532 nm Raman excitation source | CNI, China | MLL-III-532 | ||
Bluelake software | LUMICKS, Netherlands | version 1.6.12 | optical tweezer control software | |
Frame tape | Thermo Fisher Scientific, Inc | AB-0576 | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories, Inc | 16482 | ||
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) camera | Teledyn Princeton Instrument, United States | 400B eXcelon | ||
Long-pass dichroic mirror | AHF, Germany | F48-801 | ||
Magnetic laser safety screen | ThorLabs | TPSM2 | ||
Optical tweezer microscope | LUMICKS, Netherlands | m-trap | ||
Silver nitrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S8157 | ||
Spectrometer | Teledyn Princeton Instrument, United States | IsoPlane SCT-320 | ||
Trisodium citrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S4641 | ||
WinSpec software | Teledyn Princeton Instrument, United States | version 2.6.24.0 | spectrum software |