JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioengenharia

Fragmentering af bulkhydrogeler og forarbejdning til granulære hydrogeler til biomedicinske applikationer

Published: May 17, 2022
doi:
10.3791/63867
Victoria G. Muir1, Margaret E. Prendergast1, Jason A. Burdick1,2,3
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences,University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute,University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science,University of Colorado Boulder

Summary

Dette arbejde beskriver enkle, tilpasningsdygtige og billige metoder til fremstilling af mikrogeler med ekstruderingsfragmentering, behandle mikrogelerne til injicerbare granulære hydrogeler og anvende de granulære hydrogeler som ekstruderingstrykfarver til biomedicinske applikationer.

Abstract

Granulære hydrogeler er fastklemte samlinger af hydrogelmikropartikler (dvs. “mikrogeler”). Inden for biomaterialer har granulære hydrogeler mange fordelagtige egenskaber, herunder injicerbarhed, mikroskala porøsitet og tunabilitet ved at blande flere mikrogelpopulationer. Metoder til fremstilling af mikrogeler er ofte afhængige af vand-i-olie-emulsioner (f.eks. Mikrofluidik, batchemulsioner, elektrospray) eller fotolitografi, som kan stille høje krav med hensyn til ressourcer og omkostninger og muligvis ikke er kompatible med mange hydrogeler. Dette arbejde beskriver enkle, men yderst effektive metoder til fremstilling af mikrogeler ved hjælp af ekstruderingsfragmentering og til at behandle dem til granulære hydrogeler, der er nyttige til biomedicinske applikationer (f.eks. 3D-printfarver). For det første ekstruderes bulkhydrogeler (ved hjælp af fotocrosslinkbar hyaluronsyre (HA) som et eksempel) gennem en række nåle med sekventielt mindre diametre til dannelse af fragmenterede mikrogeler. Denne mikrogelfremstillingsteknik er hurtig, billig og meget skalerbar. Metoder til at jamme mikrogeler i granulære hydrogeler ved centrifugering og vakuumdrevet filtrering er beskrevet med valgfri post-tværbinding til hydrogelstabilisering. Endelig demonstreres granulære hydrogeler fremstillet af fragmenterede mikrogeler som ekstruderingstrykfarver. Mens eksemplerne beskrevet heri bruger fotocrosslinkbar HA til 3D-udskrivning, kan metoderne let tilpasses til en lang række hydrogeltyper og biomedicinske applikationer.

Introduction

Granulære hydrogeler fremstilles gennem pakning af hydrogelpartikler (dvs. mikrogeler) og er en spændende klasse af biomaterialer med mange fordelagtige egenskaber til biomedicinske anvendelser 1,2,3. På grund af deres partikelstruktur er granulære hydrogeler forskydningsfortyndende og selvhelbredende, hvilket gør det muligt at anvende dem som ekstruderingstryk (bio)blæk, granulære understøtninger til indlejret udskrivning og injicerbare terapier 4,5,6,7,8,9. Derudover giver tomrummet mellem mikrogeler en mikroskala porøsitet til cellebevægelse og molekylær diffusion 8,10,11. Endvidere kan flere mikrogelpopulationer kombineres til en enkelt formulering for at muliggøre forbedret tunabilitet og materialefunktionalitet 8,10,12,13. Disse vigtige egenskaber har motiveret den hurtige udvidelse af granulær hydrogeludvikling i de senere år.

Der er en række metoder til rådighed til at danne mikrogeler mod granulær hydrogelfremstilling, hver med sine egne fordele og ulemper. For eksempel dannes mikrogeler ofte af vand-i-olie-emulsioner ved anvendelse af dråbemikrofluidik 4,11,13,14,15,16,17, batchemulsioner 7,18,19,20,21,22 eller elektrospray 6,23, 24,25. Disse metoder giver sfæriske mikrogeler med enten ensartede (mikrofluidik) eller polydisperse (batchemulsioner, elektrospray) diametre. Der er nogle begrænsninger for disse vand-i-olie emulsion fremstillingsmetoder, herunder potentielt lav-gennemstrømning produktion, behovet for lavviskositet hydrogel forløber løsninger, og de høje omkostninger og ressourcer til opsætning. Derudover kan disse protokoller kræve hårde olier og overfladeaktive stoffer, der skal vaskes fra mikrogelerne ved hjælp af procedurer, der tilføjer behandlingstrin, og kan være vanskelige at oversætte til sterile forhold til biomedicinske applikationer i mange laboratorier. Fjernelse af behovet for vand-i-olie-emulsioner kan (foto) litografi også anvendes, hvor forme eller fotomasker bruges til at kontrollere hærdning af mikrogeler fra hydrogelprecursoropløsninger 1,26,27. Ligesom mikrofluidik kan disse metoder være begrænsede i deres produktionsgennemstrømning, hvilket er en stor udfordring, når der er behov for store mængder.

Som et alternativ til disse metoder er mekanisk fragmentering af bulkhydrogeler blevet brugt til fremstilling af mikrogeler med uregelmæssige størrelser 19,28,29,30,31,32. For eksempel kan bulkhydrogeler forformes og efterfølgende føres gennem masker eller sigter for at danne fragmenterede mikrogeler, en proces, der endda er udført i nærværelse af celler i mikrogelstrenge33,34. Bulkhydrogeler er også blevet forarbejdet til mikrogeler med mekanisk forstyrrelse ved hjælp af teknikker som slibning med mørtel og pistil eller ved brug af kommercielle blendere 35,36,37. Andre har også brugt mekanisk omrøring under hydrogeldannelse til fremstilling af fragmenterede mikrogeler (dvs. væskegeler)31.

Metoderne heri udvider disse mekaniske fragmenteringsteknikker og præsenterer en enkel tilgang til fremstilling af mikrogeler med ekstruderingsfragmentering ved hjælp af fotocrosslinkable hyaluronsyre (HA) hydrogeler som et eksempel. Ekstruderingsfragmentering bruger kun sprøjter og nåle til at fremstille fragmenterede mikrogeler i en billig, høj gennemstrømning og let skalerbar metode, der er passende til en lang række hydrogeler19,32. Endvidere beskrives metoder til at samle disse fragmenterede mikrogeler i granulære hydrogeler ved hjælp af enten centrifugering (lav pakning) eller vakuumdrevet filtrering (høj pakning). Endelig diskuteres anvendelsen af disse fragmenterede granulære hydrogeler til brug som ekstruderingstrykblæk. Målet med denne protokol er at introducere enkle metoder, der kan tilpasses en lang række hydrogeler og kan implementeres i stort set ethvert laboratorium, der er interesseret i granulære hydrogeler.

Protocol

1. Fremstilling af bulkhydrogeler inde i en sprøjte ved hjælp af photocrosslinking BEMÆRK: En oversigt over bulkhydrogelfremstilling inde i en sprøjte ved hjælp af photocrosslinking er vist i figur 1. Denne protokol bruger norbornen-modificeret hyaluronsyre (NorHA) til fremstilling af bulkhydrogeler ved hjælp af en fotomedieret thiol-ene-reaktion. Detaljerede procedurer for syntesen af NorHA er beskrevet andetsteds38. D…

Representative Results

Repræsentative resultater fra disse protokoller er vist i figur 3 og figur 6. Ekstruderingsfragmentering giver mikrogeler med takkede polygonformer med diametre fra 10-300 μm (figur 3). Endvidere varierer cirkulariteten fra 0,2 (ikke cirkulær) til næsten 1 (perfekt cirkel), og billedformatet varierer fra 1-3 (figur 3). Disse parametre beskriver de uregelmæssige og takkede mikrogelformer dannet af f…

Discussion

Heri beskrives metoder til fremstilling af granulære hydrogeler ved hjælp af ekstruderingsfragmenterede mikrogeler og pakning ved enten centrifugering eller vakuumdrevet filtrering. Sammenlignet med andre mikrogelfremstillingsmetoder (dvs. mikrofluidik, batchemulsioner, elektrospray, fotolitografi) er ekstruderingsfragmenteringsmikrogelfremstilling meget hurtig, billig, let skalerbar og modtagelig for en lang række hydrogelsystemer. Endvidere er denne protokol meget repeterbar med minimal batch-til-batch-variabilitet,…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem UPenn MRSEC-programmet (DMR-1720530) og kandidatforskningsstipendier (til V.G.M og M.E.P.) og National Institutes of Health (R01AR077362 til J.A.B.).

Materials

15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube Corning 430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) Fisher Scientific 14-823-435 Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") Grainger 5FVH5 Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") Grainger 5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") Grainger 5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 14190-250 Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm Millipore GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope Various Vendors To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Extrusion printer Custom-built Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters Fisher Scientific 05-888-107 Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) Sigma-Aldrich 52471
Glass microscope slide Various Vendors
ImageJ National Institutes of Health "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps Integrated Dispensin g Solutions 9991329
Metal spatula for scooping Various Vendors
Microcentrifuge Various Vendors Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl Microsoft Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System Excelitas Technologies S2000 Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate Fisher Scientific FB966C Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer Various Vendors
Repetier Host Hot-World GmbH & Co. KG 3D printing software
Screw-based extrusion printer Various Vendors This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software Dassault Systèmes SolidWorks Corporation Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses) Various Vendors
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1 (November 2020), 100008 (2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  9. Xin, S. et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), eabk3087 (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  11. Qazi, T. H. et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S. et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
  14. Sheikhi, A. et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192 (September 2018), 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R. et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q. et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232 (December 2019), 119725 (2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F. et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A. et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H. et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L. et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3) 035004 (2013).
  28. Gehlen, D. B. et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  30. Hsu, C. C. et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R. et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
  32. Zhang, H. et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A. et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
  34. Kessel, B. et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
  35. Hinton, T. J. et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N. et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G. et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 2201115 (2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. In Press (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N. et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, e00069 (2019).
  45. Skardal, A. et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 110, 53606 (2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 131, 56372 (2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3 (November 2017), 49-61 (2018).
  48. Ding, A. et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), e2109394 (2022).

Tags

FragmentingBulk HydrogelsGranular HydrogelsBiomedical ApplicationsBiomaterialsMethodAcessoInnovationQuímicaLaboratorySyringePrecursor SolutionPlungerTip CapPipette
check_url/pt/63867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Muir, V. G., Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (183), e63867, doi:10.3791/63867 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image