युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल कोक्ली में इम्यूनोलेबलिंग और गिनती रिबन सिनैप्स
Summary
अभिवाही अन्तर्ग्रथनी संरचनाओं और बालों की कोशिकाओं को इम्यूनोलेबलिंग करके युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल कोक्ली को संसाधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल, वृद्ध ऊतक में ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाना, कोक्ली की लंबाई का विच्छेदन और अनुमान लगाना, और कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ प्राप्त छवि ढेर में सिनैप्स की मात्रा निर्धारित करना प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
आंतरिक बाल कोशिकाओं और अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं को जोड़ने वाले रिबन सिनैप्स का नुकसान उम्र से संबंधित सुनवाई हानि का एक कारण माना जाता है। रिबन सिनैप्स के नुकसान का पता लगाने के लिए सबसे आम तरीका इम्यूनोलेबलिंग है क्योंकि यह एक व्यक्तिगत कोक्लीआ में कई टोनोटोपिक स्थानों से मात्रात्मक नमूने की अनुमति देता है। हालांकि, ब्याज की संरचनाएं बोनी कोक्लीआ के अंदर गहरी दफन हैं। गेरबिल्स का उपयोग उम्र से संबंधित सुनवाई हानि के लिए एक पशु मॉडल के रूप में किया जाता है। यहां, निर्धारण के लिए नियमित प्रोटोकॉल, इम्यूनोलेबलिंग गेरबिल कोक्लियर पूरे माउंट, कॉन्फोकल इमेजिंग, और रिबन सिनैप्स संख्या और वॉल्यूम की मात्रा निर्धारित करने का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, मूल्यवान उम्र बढ़ने वाले व्यक्तियों से अच्छी सामग्री प्राप्त करने से जुड़ी विशेष चुनौतियों पर प्रकाश डाला गया है।
गेरबिल्स को इच्छामृत्यु दी जाती है और या तो कार्डियोवैस्कुलर रूप से सुगंधित किया जाता है, या उनके टिम्पैनिक बुले को सावधानीपूर्वक खोपड़ी से विच्छेदित किया जाता है। कोक्ली को शीर्ष और आधार पर खोला जाता है और सीधे फिक्सेटिव में स्थानांतरित किया जाता है। प्रारंभिक विधि के बावजूद, कोक्ली को पोस्टफिक्स किया जाता है और बाद में डिकैल्सीफाइड किया जाता है। ऊतक को तब पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाओं और बालों की कोशिकाओं के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। अगला, कोक्ली को माध्यमिक प्रतिदीप्ति-टैग किए गए एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया जाता है जो उनके संबंधित प्राथमिक लोगों के खिलाफ विशिष्ट होते हैं। वृद्ध गेरबिल्स के कोक्ली को तब पुराने जानवरों के ऊतकों की आम तौर पर पर्याप्त पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ इलाज किया जाता है।
अंत में, कोक्ली को 6-11 खंडों में विच्छेदित किया जाता है। पूरे कोक्लियर लंबाई का पुनर्निर्माण इस तरह किया जाता है कि विशिष्ट कोक्लियर स्थानों को व्यक्तियों के बीच मज़बूती से निर्धारित किया जा सकता है। कॉन्फोकल छवि ढेर, क्रमिक रूप से अधिग्रहित, चुने हुए स्थानों पर बाल कोशिकाओं और सिनैप्स की कल्पना करने में मदद करते हैं। कॉन्फोकल स्टैक को डीकॉन्वोल्व्ड किया जाता है, और सिनैप्स को या तो इमेजजे का उपयोग करके मैन्युअल रूप से गिना जाता है, या मैटलैब में कस्टम-लिखित छवि विश्लेषण प्रक्रियाओं के साथ सिनैप्टिक संरचनाओं का अधिक व्यापक परिमाणीकरण किया जाता है।
Introduction
उम्र से संबंधित सुनवाई हानि दुनिया की सबसे प्रचलित बीमारियों में से एक है जो 65 वर्ष और उससे अधिक उम्र की दुनिया की एक तिहाई से अधिक आबादी को प्रभावित करतीहै। अंतर्निहित कारण अभी भी बहस के अधीन हैं और सक्रिय रूप से जांच की जा रही है, लेकिन अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं के साथ आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) को जोड़ने वाले विशेष सिनैप्स का नुकसान शामिल हो सकता है2. इन रिबन सिनैप्स में एक प्रीसिनेप्टिक संरचना होती है जिसमें न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट से भरे पुटिकाएं होती हैं, साथ ही पोस्टसिनेप्टिक α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलेप्रोपियोनिक एसिड (एएमपीए) ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 3,4,5 होते हैं। गेरबिल में, ~ 20 अभिवाही श्रवण तंत्रिका फाइबर एक आईएचसी 6,7,8 से संपर्क करते हैं। मोडिओलस का सामना करने वाले आईएचसी पर फाइबर बड़े सिनैप्टिक रिबन का विरोध करते हैं, जबकि आईएचसी के स्तंभ पक्ष पर जुड़ने वाले फाइबर छोटे सिनैप्टिक रिबन का सामना करते हैं (यानी, बिल्लियों9, गेरबिल7, गिनी सूअरों10, और चूहोंमें 3,11,12,13,14)। इसके अलावा, गेरबिल में, प्रीसिनेप्टिक रिबन और पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच का आकार सकारात्मक रूप से 7,14 से संबंधित है। फाइबर जो आईएचसी के मोडियोलर पक्ष पर बड़े रिबन का विरोध करते हैं, कैलिबर में छोटे होते हैं और कम सहज दर और उच्च थ्रेसहोल्ड15 होते हैं। इस बात के प्रमाण हैं कि कम सहज दर फाइबर उच्च-सहज कम-थ्रेशोल्ड फाइबर की तुलना में शोर एक्सपोजर10 और ओटोटॉक्सिक ड्रग्स16 के लिए अधिक संवेदनशील हैं, जो आईएचसी15 के स्तंभ पक्ष पर स्थित हैं।
रिबन सिनैप्स का नुकसान कोक्लियर तंत्रिका आयु से संबंधित सुनवाई हानि में जल्द से जल्द अपक्षयी घटना है, जबकि सर्पिल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं का नुकसान17,18 से पीछे है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सहसंबंध में श्रवण ब्रेनस्टेम प्रतिक्रियाओं17 और यौगिक एक्शन पोटेंशिअल8 की रिकॉर्डिंग शामिल है; हालाँकि, ये सिनैप्स हानि की सूक्ष्मता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, क्योंकि कम सहज दर फाइबर इन उपायों में योगदान नहीं करते हैं16. अधिक आशाजनक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मैट्रिक्स द्रव्यमान क्षमता-व्युत्पन्न तंत्रिका सूचकांक19 और पेरिस्टिमुलस समय प्रतिक्रिया20 हैं। हालांकि, ये केवल विश्वसनीय हैं यदि जानवर के पास श्रवण तंत्रिका फाइबर हानि से परे कोई अन्य कोक्लियर विकृति नहीं है, जो शेष श्रवण तंत्रिका तंतुओं की गतिविधि को प्रभावित करती है8. इसके अलावा, गेरबिल में व्यवहारिक रूप से मूल्यांकन किए गए थ्रेसहोल्ड को सिनैप्स संख्या21 के साथ सहसंबद्ध नहीं किया गया था। इसलिए, जीवित रिबन सिनैप्स की विश्वसनीय मात्रा का ठहराव और, इस प्रकार, कार्यात्मक श्रवण तंत्रिका तंतुओं की संख्या केवल कॉक्लियर ऊतक की प्रत्यक्ष परीक्षा द्वारा संभव है।
मंगोलियाई गेरबिल (मेरियोनेस अनगुइकुलेटस) उम्र से संबंधित सुनवाई हानि का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल है। इसका एक छोटा जीवन काल है, मनुष्यों के समान कम आवृत्ति वाली सुनवाई है, बनाए रखना आसान है, और उम्र से संबंधित सुनवाई हानि 2,22,23,24 से संबंधित मानव विकृतियों के लिए समानताएं दिखाता है। गेरबिल को वृद्ध माना जाता है जब वे 36 महीने की उम्र तक पहुंचते हैं, जो उनके औसत जीवन काल22 के अंत के करीब है। महत्वपूर्ण रूप से, रिबन सिनैप्स की उम्र से संबंधित हानि को शांत वातावरण 8,21 में उठाए गए और वृद्ध गेरबिल में प्रदर्शित किया गया है।
यहां, युवा वयस्कों से वृद्ध तक, विभिन्न उम्र के गेरबिल्स से इम्यूनोलेबल, विच्छेदन और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रीसिनैप्स (सीटीबीपी 2), पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच (ग्लूए 2), और आईएचसी (मायोवीआईआईए) के घटकों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर लागू किया जाता है जो वृद्ध कोक्ली में पृष्ठभूमि को कम करता है और प्रतिदीप्ति संकेत को बरकरार रखता है। इसके अलावा, संवेदी उपकला और स्ट्रिया संवहनी दोनों की जांच करने के लिए कोक्लीआ को विच्छेदन करने का विवरण दिया गया है। कोक्लियर लंबाई को विशिष्ट सर्वोत्तम आवृत्तियों के अनुरूप अलग-अलग कोक्लियर स्थानों के चयन को सक्षम करने के लिए मापा जाता है25. अन्तर्ग्रथन संख्याओं का परिमाणीकरण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर इमेजजे26 के साथ किया जाता है। व्यक्तिगत एचसी के भीतर अन्तर्ग्रथन वॉल्यूम और स्थानों का अतिरिक्त परिमाणीकरण मैटलैब में लिखे गए सॉफ़्टवेयर कस्टम के साथ किया जाता है। इस सॉफ़्टवेयर को सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं कराया गया है, क्योंकि लेखकों के पास पेशेवर प्रलेखन और समर्थन प्रदान करने के लिए संसाधनों की कमी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधि के साथ, युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल्स से कोक्ली में आईएचसी और सिनैप्टिक संरचनाओं को इम्युनोलेबल करना संभव है, पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक तत्वों के सह-स्थानीयकरण द्वारा अनु…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इमेजिंग सुविधाओं के उपयोग के लिए विधि और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सर्विस यूनिट, कार्ल वॉन ओसिएट्ज़की यूनिवर्सिटी ऑफ ओल्डेनबर्ग स्थापित करने में मदद करने के लिए लिचुन झांग को स्वीकार करते हैं। इस शोध को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति -ईएक्ससी 2177/1 के तहत डॉयचे फोर्शुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
Referências
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