Hurtig viskoelastisk karakterisering af luftvejsslim ved hjælp af et bænkreometer

Summary

Slimets viskoelastiske egenskaber spiller en kritisk rolle i mucociliær clearance. Imidlertid kræver traditionelle slimrologiske teknikker komplekse og tidskrævende tilgange. Denne undersøgelse giver en detaljeret protokol til brug af et benchtop reometer, der hurtigt og pålideligt kan udføre viskoelastiske målinger.

Abstract

Ved slimhindestruktive lungesygdomme (f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, cystisk fibrose) og andre luftvejssygdomme (f.eks. virale/bakterielle infektioner) ændres slimets biofysiske egenskaber ved bægercellehypersekretion, luftvejsdehydrering, oxidativ stress og tilstedeværelsen af ekstracellulært DNA. Tidligere undersøgelser viste, at sputumviskoelasticitet korrelerede med lungefunktionen, og at behandlinger, der påvirker sputumreologi (f.eks. Mucolytika), kan resultere i bemærkelsesværdige kliniske fordele. Generelt anvender reologiske målinger af ikke-newtonske væsker udførlige, tidskrævende tilgange (f.eks. Parallelle / keglepladereometre og / eller mikroperlepartikelsporing), der kræver omfattende træning for at udføre analysen og fortolke dataene. Denne undersøgelse testede pålideligheden, reproducerbarheden og følsomheden af Rheomuco, en brugervenlig stationær enhed, der er designet til at udføre hurtige målinger ved hjælp af dynamisk svingning med en forskydningsbelastningsfejning for at tilvejebringe lineære viskoelastiske moduler (G’, G”, G ^* og tan δ) og gelpunktegenskaber (γ_c og σ_c) til kliniske prøver inden for 5 minutter. Enhedens ydeevne blev valideret ved hjælp af forskellige koncentrationer af en slimsimulator, 8 MDa polyethylenoxid (PEO) og i forhold til traditionelle bulkreologimålinger. Et klinisk isolat høstet fra en intuberet patient med status astmaticus (SA) blev derefter vurderet i tredobbelte målinger, og variationskoefficienten mellem målingerne er <10%. Ex vivo brug af et potent slimreducerende middel, TCEP, på SA-slim resulterede i et femdoblet fald i elastisk modul og en ændring i retning af en mere “væskelignende” adfærd generelt (f.eks. Højere tan δ). Tilsammen viser disse resultater, at det testede benchtop reometer kan foretage pålidelige målinger af slimviskoselasticitet i kliniske og forskningsmæssige omgivelser. Sammenfattende kan den beskrevne protokol bruges til at undersøge virkningerne af mukoaktive lægemidler (f.eks. rhDNase, N-acetylcystein) på stedet for at tilpasse behandlingen fra sag til sag eller i prækliniske undersøgelser af nye forbindelser.

Introduction

Muco-obstruktive luftvejssygdomme, herunder astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), cystisk fibrose (CF) og andre luftvejssygdomme, såsom viral og bakteriel lungebetændelse, er udbredte sundhedsmæssige bekymringer over hele verden. Mens patofysiologien varierer meget mellem hver tilstand, er et fælles nøgletræk unormal mucociliær clearance. I sunde lunger linjer slim luftvejsepitelet for at fange indåndede partikler og tilvejebringe en fysisk barriere mod patogener. Når det er udskilt, transporteres luftvejsslim, der består af ~ 97,5% vand, 0,9% salt, ~ 1,1% kugleformede proteiner og ~ 0,5% muciner, gradvist mod glottis ved den koordinerede slag af cilia ^1,2. Slimhinder er store O-bundne glycoproteiner, der interagerer via ikke-kovalente og kovalente bindinger for at tilvejebringe slimets forskellige viskoelastiske egenskaber, hvilket er nødvendigt for effektiv transport³. Ændringer i slimhinnetværkets ultrastruktur forårsaget af ændret iontransport, mucinudfoldning, elektrostatiske interaktioner, tværbinding eller ændringer i sammensætning kan påvirke slimviskosiciteten betydeligt og forringe slimhindeclearance ^4,5. Derfor er det afgørende at identificere ændringer i luftvejsslimets biofysiske egenskaber for at forstå sygdomspatogenese og teste nye mukoaktive forbindelser⁶.

Forskellige faktorer kan føre til produktion af afvigende slim i lungerne. Ved KOL udløser kronisk indånding af cigaretrøg slimhypersekretion som følge af bægercellemetaplasi samt luftvejsdehydrering via nedregulering af cystisk fibrose transmembrankonduktansregulator (CFTR) kanal, hvilket forårsager slimhyperkoncentration og små luftvejsobstruktion ^7,8. Tilsvarende er CF, en genetisk lidelse forbundet med mutationer i CFTR-genet, karakteriseret ved produktion af tyktflydende, klæbende slim, der er utilstrækkeligt til transport ^8,9. Kort fortalt inducerer CFTR-dysfunktion væskeudtømning af luftvejene, polymer mucinindfiltring og øgede biokemiske interaktioner, hvilket resulterer i kronisk inflammation og bakterielle infektioner. Derudover forværrer inflammatoriske celler fanget i statisk slim yderligere slimets viskoelasticitet ved at tilføje et andet stort molekyle, DNA, i gelmatrixen, hvilket forværrer luftvejsobstruktion⁵. Et af de bedste eksempler på slimreologiens betydning for lungernes generelle sundhed er tilvejebragt af eksemplet med rekombinant human DNFase (rhDNase) til behandling af cystisk fibrose patienter. Virkningerne af rhDNase blev først demonstreret ex vivo på ekspektoreret sputum, som viste en overgang fra viskøst slim til en flydende væske inden for få minutter^10,11. Kliniske forsøg med CF-patienter viste, at reduktion af luftvejsslim viskoelasticitet med rhDNase-indånding reducerede hastigheden af lungeforværringer og forbedrede lungefunktionen og det generelle patienttrangid 12,13,14. Som følge heraf blev rhDNase-indånding med det formål at lette clearance standarden for pleje af CF-patienter i mere end to årtier. Lignende kliniske fordele blev observeret ved anvendelse af inhaleret hypertonisk saltvand til slimhydrering i CF, hvilket korrelerede med ændringer i reologiske egenskaber og resulterede i mucociliær clearance acceleration og forbedret lungefunktion ^15,16. Derfor er en hurtig og pålidelig protokol til måling af slimviskoselastiske egenskaber i kliniske omgivelser vigtig for at optimere terapeutiske tilgange.

Det bordreometer, der testes heri, er et hurtigt og bekvemt alternativ til at udføre omfattende viskoelastiske målinger af slim/sputumprøver. Ved hjælp af dynamiske svingninger med kontrolleret vinkelforskydning tilvejebringer instrumentet deformation via et par justerbare parallelle plader (f.eks. Ru eller glatte geometrier) til måling af drejningsmoment og forskydning med opløsninger på 15 nN^. m og 150 nm, henholdsvis¹⁷. En standard standardiseret kalibrering kombineret med brugerretningslinjer tilpasset ikke-reologispecialister giver mulighed for enkle målinger og reducerer risikoen for operatørfejl. Enheden producerer en belastningsfejningskurve, der behandles og analyseres i realtid (inden for ~ 5 minutter) og automatisk giver både lineære viskoelastiske (G’, G”, G ^* og tan δ) og gelpunkt (γ_c og σ_c) egenskaber (se tabel 1). Det elastiske modul eller lagringsmodulet (G’) beskriver, hvordan en prøve reagerer på stress (dvs. evnen til at vende tilbage til sin oprindelige form), mens det viskøse eller tabsmodul (G”) beskriver den energi, der spredes pr. Cyklus af sinusformet deformation (dvs. den energi, der går tabt på grund af friktion af molekyler). Det komplekse eller dynamiske modul (G*) er forholdet mellem spænding og belastning, som beskriver mængden af intern kraftopbygning som reaktion på en forskydningsforskydning (dvs. de samlede viskoelastiske egenskaber). Dæmpningsfaktoren (tan δ) er forholdet mellem det viskøse modul og det elastiske modul, hvilket indikerer en prøves evne til at sprede energi (dvs. en lav solbrun δ indikerer en elastisk dominerende / faststoflignende adfærd, mens en høj tan δ indikerer en viskøs dominerende / væskelignende adfærd). For gelpunktskarakteristika er crossover-stammen (γ_c) målestokken for forskydningsstammen, beregnet ved forholdet mellem afbøjningsvejen og forskydningsgabshøjden, hvor prøven overgår fra en faststoflignende til en væskelignende adfærd og pr. definition forekommer ved svingningsstamme, hvor G’ = G” eller tan δ = 1. Crossover-udbyttespændingen (σ_c) er et mål for mængden af stress, der påføres af den enhed, hvor den elastiske og viskøse moduli krydser. I sund sputa dominerer elasticitet den mekaniske reaktion på belastning (G ‘> G”). Ved slimhindestruktive sygdomme øges både G ‘og G” som følge af patologiske slimændringer 17,18,19. Enhedens operationelle enkelhed letter målinger på stedet og omgår behovet for prøveopbevaring/transport/forsendelse til en offsite-facilitet til analyse, hvorved tids- og fryse-optøningsvirkningerne på disse biologiske prøvers egenskaber undgås.

I denne undersøgelse blev 8 MDa polyethylenoxidopløsninger (PEO) med forskellige koncentrationer (1%-3%) anvendt til at validere måleområdet for et kommercielt bordreometer (Table of Materials), og den opnåede koncentrationsafhængige kurve blev direkte sammenlignet med målinger erhvervet med et traditionelt bulkreometer (Table of Materials) ). Repeterbarheden af reologiske målinger blev derefter vurderet ved hjælp af bronkoskopisk høstet slim fra en intuberet patient, der lider af status astmaticus (SA), en ekstrem form for astmaforværring karakteriseret ved bronkospasme, eosinofil inflammation og slimhyperproduktion som reaktion på et miljø- eller infektiøst middel ^8,20 . I dette tilfælde var SA-patienten blevet intuberet for svær respirationssvigt og krævede ECMO (ekstrakorporeal membraniltning) på grund af manglende evne til at støtte patienten effektivt og sikkert med mekanisk ventilation alene på trods af aggressive standard astmabehandlinger. Under en klinisk indiceret bronkoskopi for lobarkollaps blev tykke, klare, vedholdende sekreter noteret for at hindre lobar bronkier og blev aspireret ved hjælp af saltvandsvask. Umiddelbart efter indsamlingen blev overskydende saltvand fjernet fra aspiraten, og de viskoelastiske egenskaber af den resterende SA-prøve blev analyseret ved anvendelse af bordpladeindretningen. Yderligere prøvealikvoter blev behandlet med et reduktionsmiddel, tris (2-carboxylethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP), for at afgøre, om denne protokol kunne anvendes til at karakterisere terapeutisk forbindelses effektivitet ex vivo.

Resultaterne viste, at denne protokol og benchtop-enheden kan bruges effektivt i en klinisk indstilling. De reologiske egenskaber bestemt ud fra PEO-koncentrationsafhængige kurver (figur 1A) kunne ikke skelnes mellem den testede stationære enhed og et traditionelt parallelt pladereometer (figur 1B). Tredobbelte målinger af SA-slimet kunne gentages med en variationskoefficient på 10 % for G*-, G-, G- og G-endepunkterne og afspejlede de betydelige abnormiteter i slimviskoselasticitet, der var klinisk synlige i denne patients tilfælde (figur 1D). Endelig resulterede ex vivo-behandling med TCEP i en signifikant reduktion i G’ og G” og en stigning i tan δ, hvilket viste lydhørhed over for behandlingen ved ændringer i mucinnetværket (figur 2). Afslutningsvis giver denne protokol ved hjælp af et benchtop reometer en enkel og effektiv tilgang til vurdering af viskoelastiske egenskaber af slimprøver opnået fra klinikken. Denne kapacitet kan bruges til at lette præcisionsmedicinske tilgange til pleje, da klinikere kan teste effekten af godkendte mukoaktive lægemidler på stedet, hvilket kan hjælpe med at identificere alternative behandlingsmuligheder. Derudover kan denne tilgang anvendes i kliniske forsøg til at undersøge virkningerne af forsøgslægemidler.

Protocol

I den foreliggende undersøgelse blev prøver indsamlet under en klinisk indiceret bronkoskopi efter at have opnået informeret samtykke i henhold til en protokol godkendt af UNC Institutional Review Board. 1. Opsamling og opbevaring af sputum/slim Saml luftvejsslim via sputumopsamling eller bronkoskopi aspiration. Saml sputum enten via spontan ekspektorering eller inducer sputum ved 3% hypertonisk saltvandsindånding. Alternativt aspirerer …

Representative Results

Figur 1 viser nøjagtigheden og repeterbarheden af reologiske målinger ved hjælp af koncentrationsafhængige kurver for viskoelastisk kontrol, dvs. polyethylenoxidopløsning (PEO) og status asthmaticus (SA) slim. Målinger af viskoelastiske egenskaber ved 8 MDa PEO i fem forskellige koncentrationer (1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%) blev direkte sammenlignet mellem det evaluerede benchtop reometer og et traditionelt bulkreometer (Table of Materials). I modsætning til SA-slim var …

Discussion

Slimets unikke viskoelastiske egenskaber er afgørende for at opretholde sunde luftveje. Interne og eksterne faktorer kan ændre luftvejsslim biofysiske egenskaber, hvilket forårsager kliniske komplikationer, der er karakteristiske for muco-obstruktive sygdomme. Derfor kan overvågning af ændringer i slimviskoselasticitet overvejes under vurderinger af sygdomsstatus og udforskning af terapier, der reducerer slimviskoselasticitet. Empiriske undersøgelser fra 1980’erne viste en stærk sammenhæng mellem slimreologi og l…

Materials

Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.