אפיון ויסקואלסטי מהיר של ריר דרכי הנשימה באמצעות רומטר בנצ'טופ
Summary
התכונות הוויסקואלסטיות של הריר ממלאות תפקיד קריטי בפינוי הריריות. עם זאת, טכניקות ריאולוגיות מסורתיות של ריר דורשות גישות מורכבות וגוזלות זמן. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימוש ברומטר ספסל שיכול לבצע במהירות ובאמינות מדידות ויסקואלסטיות.
Abstract
במחלות ריאה חסימתיות(למשל, אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, סיסטיק פיברוזיס) ומצבים נשימתיים אחרים (למשל, זיהומים נגיפיים/חיידקיים), תכונות ביופיזיות של ריר משתנות על ידי היפר-סקרציה של תאי גביע, התייבשות דרכי הנשימה, עקה חמצונית ונוכחות של דנ”א חוץ-תאי. מחקרים קודמים הראו כי כיח צמיגות נמצא בקורלציה עם תפקוד ריאתי וכי טיפולים המשפיעים על ריאולוגיה של כיח (למשל, רירית) יכולים להביא ליתרונות קליניים יוצאי דופן. באופן כללי, מדידות ריאולוגיות של נוזלים שאינם ניוטוניים משתמשות בגישות משוכללות שגוזלות זמן רב (למשל, רהומטרים מקבילים/לוחות חרוט ו/או מעקב אחר חלקיקי מיקרובאד) הדורשות אימון נרחב כדי לבצע את הבדיקה ולפרש את הנתונים. מחקר זה בחן את האמינות, יכולת השכפול והרגישות של Rheomuco, מכשיר ספסל ידידותי למשתמש שנועד לבצע מדידות מהירות באמצעות תנודה דינמית עם טאטוא זן גזירה כדי לספק מודולי ויסקואלסטיים ליניאריים (G’, G”, G*, ו-tan δ) ומאפייני נקודת ג’ל (γc ו-σc) עבור דגימות קליניות תוך 5 דקות. ביצועי המכשיר אומתו באמצעות ריכוזים שונים של סימולנט ריר, 8 תחמוצת פוליאתילן MDa (PEO), ובניגוד למדידות ריאולוגיות מסורתיות בתפזורת. מבודד קליני שנקטף מחולה אינטובאט עם סטטוס אסתמטיקוס (SA) הוערך לאחר מכן במדידות משולשות ומקדם השונות בין המדידות הוא <10%. השימוש ב-Ex vivo בחומר חזק להפחתת ריר, TCEP, על ריר SA הביא לירידה של פי חמישה במודולוס האלסטי ולשינוי לכיוון התנהגות “דמוית נוזל” יותר באופן כללי (למשל, δ שיזוף גבוהים יותר). יחד, תוצאות אלה מראות כי מד הספסל שנבדק יכול לבצע מדדים אמינים של צמיגות ריריות במסגרות קליניות ומחקריות. לסיכום, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ריריות (למשל, rhDNase, N-אצטיל ציסטאין) באתר כדי להתאים את הטיפול על בסיס כל מקרה לגופו, או במחקרים פרה-קליניים של תרכובות חדשות.
Introduction
מחלות דרכי הנשימה החוסמות לריריות, כולל אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס (CF) ומצבים נשימתיים אחרים, כגון דלקת ריאות נגיפית וחיידקית, הן חששות בריאותיים נפוצים ברחבי העולם. בעוד שהפתופיזיולוגיה משתנה מאוד בין כל מצב, מאפיין מפתח משותף הוא פינוי ריריות לא תקין. בריאות, ריר קושר את אפיתל דרכי הנשימה כדי ללכוד חלקיקים בשאיפה ולספק מחסום פיזי נגד פתוגנים. לאחר ההפרשה, ריר דרכי הנשימה, המורכב מכ-97.5% מים, 0.9% מלח, כ-1.1% חלבונים כדוריים וכ-0.5% מוקינים, מועבר בהדרגה לכיוון הגלוטי על ידי הכאה מתואמת של ריסונים 1,2. מוקינים הם גליקופרוטאינים גדולים המקושרים ל-O, המקיימים אינטראקציה באמצעות קשרים לא קוולנטיים וקוולנטיים, כדי לספק את התכונות הוויסקואלסטיות המובהקות של ריר, הנדרשות להובלה יעילה3. שינויים במבנה האולטרה-מבנה של רשת המוצין הנגרמים על ידי שינוי בהעברת יונים, התפתחות מוצין, אינטראקציות אלקטרוסטטיות, קישור צולב או שינויים בהרכב יכולים להשפיע באופן משמעותי על צמיגות הריר ולפגוע בפינויהריריות 4,5. לפיכך, זיהוי שינויים בתכונות הביופיזיות של ריר דרכי הנשימה חיוני להבנת פתוגנזה של מחלות ולבדיקת תרכובות ריריות חדשניות6.
גורמים שונים יכולים להוביל לייצור של ריר חריגה בריאות. ב- COPD, שאיפה כרונית של עשן סיגריות גורמת להיפר-סקרציה של ריר כתוצאה ממטאפלזיה של תאי גביע, כמו גם התייבשות דרכי הנשימה באמצעות ויסות של תעלת מווסת ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנסממברנה (CFTR), הגורמת להיפר-קונסנטציה של ריר וחסימת דרכי הנשימה הקטנה 7,8. באופן דומה, CF, הפרעה גנטית הקשורה למוטציות בגן CFTR, מאופיינת בייצור של ריר צמיג ודבק שאינו מספיק להובלה 8,9. בקצרה, תפקוד לקוי של CFTR גורם לדלדול נוזלי של פני השטח של דרכי הנשימה, להסתבכות של מוצין פולימרי ולאינטראקציות ביוכימיות מוגברות, הגורמות לדלקת כרונית ולזיהומים חיידקיים. בנוסף, תאים דלקתיים הלכודים בריר סטטי מחריפים עוד יותר את הצמיגות של הריר על ידי הוספת מולקולה גדולה נוספת, DNA, למטריצת הג’ל, ומחמירים את חסימת דרכי הנשימה5. אחת הדוגמאות הטובות ביותר לחשיבותה של ריאולוגיה של ריר על הבריאות הכללית של הריאות מסופקת על ידי הדוגמה של DNFase אנושי רקומביננטי (rhDNase) בטיפול בחולי סיסטיק פיברוזיס. ההשפעות של rhDNase הודגמו לראשונה ex vivo על כיח צפוי, שהראה מעבר מריר צמיג לנוזל זורם תוך דקות10,11. ניסויים קליניים בחולי CF הראו כי הפחתת צמיגות הליחה של דרכי הנשימה באמצעות שאיפת rhDNase הפחיתה את קצב ההחמרות הריאתיות, ושיפרה את תפקוד הריאות ואת רווחתם הכללית שלהמטופלים 12,13,14. כתוצאה מכך, שאיפת rhDNase שמטרתה להקל על הסילוק הפכה לסטנדרט הטיפול בחולי CF במשך יותר משני עשורים. יתרונות קליניים דומים נצפו עם השימוש במי מלח היפרטוניים בשאיפה להידרציה של ריר ב- CF, אשר תאם עם שינויים בתכונות ריאולוגיות והביא להאצת פינוי ריריות ושיפור תפקוד הריאות15,16. לפיכך, פרוטוקול מהיר ואמין למדידת תכונות ויסקואלסטיות של ריר במסגרות קליניות חשוב כדי לייעל את הגישות הטיפוליות.
מד ה- benchtop הנבדק כאן מציע אלטרנטיבה מהירה ונוחה לביצוע מדידות ויסקואלסטיות מקיפות של דגימות ריר / כיח. באמצעות תנודות דינמיות עם תזוזה זוויתית מבוקרת, המכשיר מספק דפורמציה באמצעות זוג לוחות מקבילים מתכווננים (למשל, גיאומטריות גסות או חלקות) למדידת המומנט והתזוזה ברזולוציות של 15 nN. m ו- 150 ננומטר, בהתאמה17. כיול סטנדרטי המוגדר כברירת מחדל בשילוב עם הנחיות משתמש המותאמות למומחי ריאולוגיה שאינם מומחים לריאולוגיה מאפשר מדידות פשוטות ומפחית את הסיכון לשגיאות מפעיל. המכשיר מייצר עקומת טאטוא מתח המעובדת ומנותחת בזמן אמת (תוך כ-5 דקות) ומספקת באופן אוטומטי הן את המאפיינים הוויסקואלסטיים הליניאריים (G’, G”, G*, ו-tan δ) והן את נקודת הג’ל (γc ו-σ c) (ראו טבלה 1). מודולוס אלסטי או מודולוס אחסון (G’) מתאר כיצד דגימה מגיבה ללחץ (כלומר, היכולת לחזור לצורתה המקורית), בעוד שמודולוס הצמיג או האובדן (G”) מתאר את האנרגיה המתפזרת לכל מחזור של דפורמציה סינוסואידלית (כלומר, האנרגיה שאבדה עקב חיכוך של מולקולות). המודולוס המורכב או הדינמי (G*) הוא היחס בין מתח למתח, המתאר את כמות הצטברות הכוחות הפנימיים בתגובה לתזוזה גזירה (כלומר, התכונות הוויסקואלסטיות הכוללות). גורם השיכוך (tan δ) הוא היחס בין המודולוס הצמיג למודולוס האלסטי, מה שמצביע על יכולתו של מדגם לפזר אנרגיה (כלומר, δ שיזוף נמוך מצביע על התנהגות אלסטית-דומיננטית/דמוית מוצק, בעוד δ שיזוף גבוה מצביע על התנהגות צמיגת-דומיננטית/נוזלית). עבור מאפייני נקודת הג’ל, זן ההצלבה (γc) הוא המדד של זן הגזירה, המחושב על ידי היחס בין נתיב הסטייה לגובה מרווח הגזירה, שבו הדגימה עוברת מהתנהגות דמוית מוצק להתנהגות דמוית נוזל ומתרחשת, מעצם הגדרתה, בזן התנודה שבו G’ = G” או tan δ = 1. מתח תשואת ההצלבה (σc) הוא מדד לכמות הלחץ המופעלת על ידי המכשיר שבו המודולי האלסטי והצמיג חוצה. בספוטה בריאה, האלסטיות שולטת בתגובה המכנית למתח (G’ > G”). במחלות ריריות-חסימתיות, גם G’ וגם G” עולות כתוצאה משינויים פתולוגיים בליחה 17,18,19. הפשטות התפעולית של המכשיר מאפשרת מדידות באתר ועוקפת את הצורך באחסון/הובלה/משלוח של דגימות למתקן מחוץ לאתר לצורך ניתוח ובכך מונעת את השפעות הזמן וההפשרה ההקפאה על תכונותיהן של דגימות ביולוגיות אלה.
במחקר זה, 8 פתרונות של תחמוצת פוליאתילן MDa (PEO) בריכוזים שונים (1%-3%) שימשו לאימות טווח המדידה של ריאמטר ספסל מסחרי (טבלת חומרים) והעקומה התלויה בריכוז המתקבלת הושוותה ישירות למדידות שנרכשו עם רומטר מסורתי בתפזורת (טבלת חומרים) ). יכולת החזרה של מדידות ריאולוגיות הוערכה לאחר מכן באמצעות ריר שנקטף ברונכוסקופי מחולה אינטובאטוס הסובל מסטטוס אסתמטיקוס (SA), צורה קיצונית של החמרה באסתמה המאופיינת בברונכוספזם, דלקת אאוזינופילית והיפר-פרודוקציה של ריר בתגובה לחומר סביבתי או זיהומי 8,20 . במקרה זה, חולה ה-SA הוחדר בשל כשל נשימתי חמור ונזקק ל-ECMO (חמצון ממברנה חוץ-גופית) בשל חוסר היכולת לתמוך בחולה ביעילות ובבטחה עם הנשמה מכנית בלבד, למרות טיפולי אסתמה סטנדרטיים אגרסיביים. במהלך ברונכוסקופיה שצוינה קלינית לקריסת לובר, נצפו הפרשות עבות, שקופות ועקשניות שחוסמות את הסמפונות הלובריים ושואפות באמצעות שטיפות מלוחות. מיד לאחר האיסוף, עודף מלח הוסר מהשאיפה והתכונות הוויסקואלסטיות של דגימת ה- SA הנותרת נותחו באמצעות התקן ה- benchtop. דגימות נוספות של אליקוטים טופלו בחומר מחזר, טריס (2-קרבוקסילאתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP), כדי לקבוע אם פרוטוקול זה עשוי לשמש לאפיון יעילות תרכובת טיפולית ex vivo.
התוצאות הראו כי פרוטוקול זה ומכשיר ה- benchtop יכולים לשמש ביעילות במסגרת קלינית. התכונות הריאולוגיות שנקבעו מתוך עקומות תלויות ריכוז PEO (איור 1A) לא היו ניתנות להבחנה בין התקן הספסל הנבדק לבין רומטר לוח מקבילי מסורתי (איור 1B). מדידות משולשות של ריר ה-SA היו ניתנות לחזרה, עם מקדם וריאציה של 10% עבור נקודות הקצה של G*, G’ ו-G” ושיקפו את החריגות המשמעותיות בצמיגות הריר שהיו ניכרות קלינית במקרה של מטופל זה (איור 1D). לבסוף, טיפול ב-ex vivo עם TCEP הביא לירידה משמעותית ב-G’ וב-G”, ולעלייה δ השיזוף, מה שהדגים את ההיענות לטיפול על ידי שינויים ברשת המוצין (איור 2). לסיכום, פרוטוקול זה באמצעות rheometer benchtop מספק גישה פשוטה ויעילה להערכת תכונות ויסקואלסטיות של דגימות ריר המתקבלות מהמרפאה. יכולת זו עשויה לשמש כדי להקל על גישות לרפואה מדויקת לטיפול, שכן קלינאים יכולים לבחון את היעילות של תרופות ריריות מאושרות באתר, מה שיכול לסייע בזיהוי אפשרויות טיפול חלופיות. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש בניסויים קליניים כדי לבחון את ההשפעות של תרופות ניסיוניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
התכונות הויסקואלסטיות הייחודיות של ריר חיוניות לשמירה על דרכי הנשימה הבריאות. גורמים פנימיים וחיצוניים יכולים לשנות את התכונות הביופיזיות של ריר דרכי הנשימה, ולגרום לסיבוכים קליניים האופייניים למחלות חסימתיות ריריות. לפיכך, ניתן לשקול מעקב אחר שינויים בצמיגות הריר במהלך הערכות של מצב ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מאמר זה נתמך על ידי מענקים מ-Vertex Pharmaceuticals (פרס Ehre RIA) וממחקר EHRE20XX0 הנתמך על ידי CFF.
Materials
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
Referências
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
