Snabb viskoelastisk karakterisering av luftvägsslem med hjälp av en bänkskiva Reometer

Summary

De viskoelastiska egenskaperna hos slem spelar en kritisk roll vid mucociliary clearance. Traditionella slemreologiska tekniker kräver emellertid komplexa och tidskrävande tillvägagångssätt. Denna studie ger ett detaljerat protokoll för användning av en bänkreometer som snabbt och tillförlitligt kan utföra viskoelastiska mätningar.

Abstract

Vid muko-obstruktiva lungsjukdomar (t.ex. astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, cystisk fibros) och andra andningssjukdomar (t.ex. virus-/bakterieinfektioner) förändras slemets biofysiska egenskaper av bägarecellshypersekretion, uttorkning av luftvägarna, oxidativ stress och närvaron av extracellulärt DNA. Tidigare studier visade att sputumviskopelasticitet korrelerade med lungfunktionen och att behandlingar som påverkar sputumreologi (t.ex. mukolytika) kan resultera i anmärkningsvärda kliniska fördelar. I allmänhet använder reologiska mätningar av icke-newtonska vätskor utarbetade, tidskrävande metoder (t.ex. parallella / konplattreometrar och / eller mikrobpartikelspårning) som kräver omfattande träning för att utföra analysen och tolka data. Denna studie testade tillförlitligheten, reproducerbarheten och känsligheten hos Rheomuco, en användarvänlig bänkskiva som är utformad för att utföra snabba mätningar med dynamisk svängning med ett skjuvspänningssvep för att ge linjär viskoelastisk moduli (G ‘, G “, G ^* och tan δ) och gelpunktsegenskaper (γ_c och σ_c) för kliniska prover inom 5 minuter. Enhetens prestanda validerades med olika koncentrationer av en slemsimulator, 8 MDa polyetenoxid (PEO), och mot traditionella bulkreologimätningar. Ett kliniskt isolat som skördats från en intuberad patient med status asthmaticus (SA) bedömdes sedan i tredubbla mätningar och variationskoefficienten mellan mätningarna är <10%. Ex vivo-användning av ett potent slemreducerande medel, TCEP, på SA-slem resulterade i en femfaldig minskning av elastisk modul och en förändring mot ett mer “vätskeliknande” beteende totalt sett (t.ex. högre δ). Tillsammans visar dessa resultat att den testade bänkskivans reometer kan göra tillförlitliga mått på slemviskopelasticitet i kliniska och forskningsmiljöer. Sammanfattningsvis kan det beskrivna protokollet användas för att undersöka effekterna av mukoaktiva läkemedel (t.ex. rhDNas, N-acetylcystein) på plats för att anpassa behandlingen från fall till fall eller i prekliniska studier av nya föreningar.

Introduction

Muco-obstruktiva luftvägssjukdomar, inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), cystisk fibros (CF) och andra andningssjukdomar, såsom viral och bakteriell lunginflammation, är vanliga hälsoproblem över hela världen. Medan patofysiologin varierar mycket mellan varje tillstånd, är en vanlig nyckelfunktion onormal mucociliär clearance. I friska lungor leder slem luftvägsepitelet för att fånga inhalerade partiklar och ge en fysisk barriär mot patogener. När det väl utsöndrats transporteras luftvägsslem, bestående av ~ 97,5% vatten, 0,9% salt, ~ 1,1% klotformiga proteiner och ~ 0,5% muciner, gradvis mot glottis genom samordnad slagning av cilia ^1,2. Muciner är stora O-länkade glykoproteiner som interagerar via icke-kovalenta och kovalenta bindningar för att ge de distinkta viskoelastiska egenskaperna hos slem, vilket krävs för effektiv transport³. Förändringar i ultrastrukturen i mucinnätverket orsakade av förändrad jontransport, mucinutfällning, elektrostatiska interaktioner, tvärbindning eller förändringar i kompositionen kan signifikant påverka slemviskopelasticiteten och försämra mucociliary clearance ^4,5. Därför är det viktigt att identifiera förändringar i de biofysiska egenskaperna hos luftvägsslem för att förstå sjukdomspatogenes och testa nya mukoaktiva föreningar⁶.

Olika faktorer kan leda till produktion av avvikande slem i lungorna. Vid KOL utlöser kronisk inandning av cigarettrök slemhypersekretion som ett resultat av metaplasi i bägare, liksom uttorkning av luftvägarna via nedreglering av kanalen cystisk fibros transmembrankonduktansregulator (CFTR), vilket orsakar slemhyperkoncentration och liten luftvägsobstruktion ^7,8. På samma sätt kännetecknas CF, en genetisk störning associerad med mutationer i CFTR-genen, av produktion av visköst, vidhäftande slem som är otillräckligt för transport ^8,9. I korthet inducerar CFTR-dysfunktion vätskeutarmning av luftvägsytan, polymer mucin intrassling och ökade biokemiska interaktioner, vilket resulterar i kronisk inflammation och bakterieinfektioner. Dessutom förvärrar inflammatoriska celler fångade i statiskt slem ytterligare viskoelasticiteten hos slem genom att tillsätta en annan stor molekyl, DNA, i gelmatrisen, förvärra luftvägsobstruktion⁵. Ett av de bästa exemplen på vikten av slemreologi på lungans allmänna hälsa tillhandahålls av exemplet med rekombinant human DNFase (rhDNase) vid behandling av cystisk fibrospatienter. Effekterna av rhDNas visades först ex vivo på slemlösat sputum, vilket visade en övergång från visköst slem till en flytande vätska inom några minuter^10,11. Kliniska prövningar på CF-patienter visade att minskning av luftvägsslem viskoelasticitet med rhDNase inhalation minskade frekvensen av lungförvärringar och förbättrade lungfunktionen och patientens övergripande välbefinnande 12,13,14. Som ett resultat blev rhDNase inhalation som syftade till att underlätta clearance vårdstandarden för CF-patienter i mer än två decennier. Liknande kliniska fördelar observerades vid användning av inhalerad hypertonisk saltlösning för slemhydrering vid CF, vilket korrelerade med förändringar i reologiska egenskaper och resulterade i mucociliär clearanceacceleration och förbättrad lungfunktion^15,16. Därför är ett snabbt och tillförlitligt protokoll för att mäta slem viskoelastiska egenskaper i kliniska miljöer viktigt för att optimera terapeutiska metoder.

Bänkskivans reometer som testas här erbjuder ett snabbt och bekvämt alternativ för att utföra omfattande viskoelastiska mätningar av slem / sputumprover. Med hjälp av dynamiska svängningar med kontrollerad vinkelförskjutning ger instrumentet deformation via ett par justerbara parallella plattor (t.ex. grova eller släta geometrier) för att mäta vridmoment och förskjutning med upplösningar på 15 nN^. m respektive 150 nm¹⁷. En standardiserad kalibrering i kombination med användarriktlinjer anpassade för icke-reologispecialister möjliggör enkla mätningar och minskar risken för operatörsfel. Enheten producerar en töjningssvepkurva som bearbetas och analyseras i realtid (inom ~ 5 min) och ger automatiskt både linjära viskoelastiska (G ‘, G “, G ^* och tan δ) och gelpunkt (γ_c och σ_c) egenskaper (se tabell 1). Den elastiska eller lagringsmodulen (G ‘) beskriver hur ett prov reagerar på stress (dvs. förmågan att återgå till sin ursprungliga form), medan den viskösa eller förlustmodulen (G”) beskriver den energi som försvinner per cykel av sinusformad deformation (dvs den energi som förloras på grund av molekylernas friktion). Den komplexa eller dynamiska modulen (G*) är förhållandet mellan spänning och töjning, som beskriver mängden intern kraftuppbyggnad som svar på en skjuvförskjutning (dvs. de totala viskoelastiska egenskaperna). Dämpningsfaktorn (tan δ) är förhållandet mellan den viskösa modulen och den elastiska modulen, vilket indikerar ett provs förmåga att sprida energi (dvs. en låg solbränna δ indikerar ett elastiskt dominerande / fastliknande beteende, medan en hög solbränna δ indikerar ett visköst dominerande / vätskeliknande beteende). För gelpunktsegenskaper är crossover-stammen (γ_c) måttet på skjuvspänningen, beräknad med förhållandet mellan avböjningsvägen och skjuvgapets höjd, vid vilken provet övergår från ett fastliknande till ett vätskeliknande beteende och per definition uppträder vid oscillationsspänning där G ‘ = G ” eller solbränna δ = 1. Crossover-utbytesspänningen (σ_c) är ett mått på mängden spänning som appliceras av anordningen vid vilken den elastiska och viskösa modulen korsar varandra. I hälsosam sputa dominerar elasticiteten det mekaniska svaret på töjning (G’ > G”). Vid muco-obstruktiva sjukdomar ökar både G’ och G” till följd av patologiska slemförändringar 17,18,19. Enhetens operativa enkelhet underlättar mätningar på plats och kringgår behovet av provlagring / transport / transport till en extern anläggning för analys, vilket undviker tids- och frys-tina effekter på egenskaperna hos dessa biologiska prover.

I denna studie användes 8 MDa polyetenoxidlösningar (PEO) med olika koncentrationer (1% -3%) för att validera mätområdet för en kommersiell bänktreometer (materialtabell) och den erhållna koncentrationsberoende kurvan jämfördes direkt med mätningar som erhållits med en traditionell bulkreometer (materialtabell ). Repeterbarheten av reologiska mätningar bedömdes sedan med hjälp av bronkoskopiskt skördat slem från en intuberad patient som lider av status asthmaticus (SA), en extrem form av astmaförvärring som kännetecknas av bronkospasm, eosinofil inflammation och slemhyperproduktion som svar på ett miljö- eller smittämne^{8 20} . I detta fall hade SA-patienten intuberats för svår andningssvikt och krävde ECMO (extrakorporeal membransyresättning) på grund av oförmågan att stödja patienten effektivt och säkert med enbart mekanisk ventilation, trots aggressiva standardastmaterapier. Under en kliniskt indikerad bronkoskopi för lobar kollaps noterades tjocka, klara, ihärdiga sekret som hindrar lobar bronkier och aspirerades med saltlösning. Omedelbart efter insamling avlägsnades överskott av saltlösning från aspiranten och de viskoelastiska egenskaperna hos det återstående SA-provet analyserades med användning av bänkskivan. Ytterligare prov alikvoter behandlades med ett reduktionsmedel, tris (2-karboxyletyl) fosfinhydroklorid (TCEP), för att avgöra om detta protokoll kan användas för att karakterisera terapeutisk föreningseffekt ex vivo.

Resultaten visade att detta protokoll och bänkskivan kan användas effektivt i en klinisk miljö. De reologiska egenskaper som bestämdes utifrån PEO-koncentrationsberoende kurvor (figur 1A) kunde inte skiljas mellan den testade bänkskivan och en traditionell parallellplåtsreometer (figur 1B). Tredubbla mätningar av SA-slemmet var repeterbara, med en variationskoefficient på 10% för G *, G ‘, och G “slutpunkter och återspeglade de väsentliga avvikelserna i slemviskopelasticitet som var kliniskt uppenbara i denna patients fall (figur 1D). Slutligen resulterade ex vivo-behandling med TCEP i en signifikant minskning av G ‘och G”, och en ökning av solbränna δ, vilket visar lyhördhet för behandlingen genom förändringar i mucinnätverket (figur 2). Sammanfattningsvis ger detta protokoll med hjälp av en bänkreometer ett enkelt och effektivt tillvägagångssätt för att bedöma viskoelastiska egenskaper hos slemprover erhållna från kliniken. Denna förmåga kan användas för att underlätta precisionsmedicinska metoder för vård, eftersom kliniker kan testa effekten av godkända mukoaktiva läkemedel på plats, vilket kan hjälpa till att identifiera alternativa behandlingsalternativ. Dessutom kan detta tillvägagångssätt användas i kliniska prövningar för att undersöka effekterna av prövningsläkemedel.

Protocol

I den aktuella studien samlades prover in under en kliniskt indikerad bronkoskopi efter att ha erhållit informerat samtycke enligt ett protokoll som godkänts av UNC Institutional Review Board. 1. Sputum / slemuppsamling och lagring Samla luftvägsslem via sputumuppsamling eller bronkoskopi aspiration. Samla sputum antingen via spontan expectoration eller inducera sputum genom 3% hypertonisk saltlösning inandning. Alternativt, direkt aspir…

Representative Results

Figur 1 visar noggrannheten och repeterbarheten för reologiska mätningar med koncentrationsberoende kurvor för viskoelastisk kontroll, dvs. polyetenoxidlösning (PEO) och status asthmaticus (SA) slem. Mätningar av viskoelastiska egenskaper hos 8 MDa PEO vid fem olika koncentrationer (1%, 1,5%, 2%, 2,5% och 3%) jämfördes direkt mellan den utvärderade bänkskivans reometer och en traditionell bulkreometer (materialtabell). I motsats till SA-slem var PEO-lösningar visk?…

Discussion

De unika viskoelastiska egenskaperna hos slem är viktiga för att upprätthålla friska luftvägar. Interna och externa faktorer kan förändra luftvägsslem biofysiska egenskaper, vilket orsakar kliniska komplikationer som är karakteristiska för muco-obstruktiva sjukdomar. Därför kan övervakning av förändringar i slemviskopelasticitet övervägas vid bedömningar av sjukdomsstatus och utforskning av terapier som minskar slemviskopelasticitet. Empiriska studier från 1980-talet visade en stark korrelation mellan …

Materials

Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.