滑膜関節バイオメカニクス、メカノバイオロジー、物理調節の研究のための摩擦試験バイオリアクター装置
Summary
本プロトコルは、接触する2つの生物学的対向面に同時に相互摺動および通常の荷重を加える摩擦試験装置を記載する。
Abstract
原発性変形性関節症(OA)では、加齢に伴う正常な「摩耗と涙」は、軟骨がその耐荷重および潤滑機能を維持する能力を阻害し、有害な物理的環境を助長する。関節軟骨と滑膜の摩擦相互作用は、組織レベルの摩耗および細胞メカノトランスダクションを介して関節の恒常性に影響を与える可能性がある。これらの機械的および機械的プロセスを研究するために、関節の動きを複製することができる装置が記載されている。摩擦試験装置は、2つの接触する生物学的対向面への相互平行移動運動および通常の荷重の送達を制御する。この研究は滑膜軟骨構成を採用し、摩擦係数測定はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または滑液(SF)浴中で実施された試験のために提示される。試験は、高負荷下でのSFの潤滑特性を強調し、接触応力の範囲に対して実施された。この摩擦試験装置は、二節骨関節関節に関連する適用された生理学的負荷に応答して生きている関節組織の物理的調節を研究するための生体模倣バイオリアクターとして使用することができる。
Introduction
変形性関節症(OA)は、3200万人以上の米国成人が罹患する衰弱性変性関節疾患であり、医療費および社会経済的費用は165億ドルを超えています1。この疾患は、古典的には、関節軟骨および軟骨下骨の分解によって特徴付けられてきた。しかし、滑膜炎がOAの症状および進行に関連しているため、滑膜への変化は最近高く評価されている2,3,4。原発性(特発性)OAでは、加齢に伴う正常な「摩耗と涙」は、軟骨がその耐荷重および潤滑機能を維持する能力を阻害する。関節軟骨層の長時間の摺接またはインプラント材料に対する軟骨の摺接によって生じる応力は、表面下疲労破壊5、6による層間剥離摩耗を促進することが示されている。関節7,8内に動的機械的環境が存在するため、関節軟骨と滑膜の摩擦相互作用は、組織レベルの摩耗および細胞メカノトランスダクションを介して関節の恒常性に影響を与え得る。これらの機械的および機械的プロセスを研究するために、圧縮荷重および摩擦荷重5,6,9,10,11,12,13を厳密に制御して、関節の動きを再現する装置が設計されている。
本プロトコルは、生体組織外植体の接触面に相互の平行移動運動および圧縮荷重を送達する摩擦試験装置を記載する。コンピュータ制御デバイスにより、各テストの所要時間、加えられた負荷、平行移動ステージの可動域、および平行移動速度をユーザーが制御できます。このデバイスはモジュール式で、組織オンティッシュ(軟骨オン軟骨および滑膜オン軟骨)やティッシュオンガラスなど、さまざまなカウンターフェースのテストが可能です。試験者によって得られた機能的測定値に加えて、組織および潤滑浴成分は、所与の実験レジメンによって付与される生物学的変化を評価するために、試験の前後に評価することができる。
軟骨トライボロジーの研究は何十年も前から行われており、軟骨とガラスおよび軟骨上の軟骨との間の摩擦係数を測定するためにいくつかの技術が開発されてきた14,15。異なるアプローチは、関心のあるジョイントおよび/または潤滑機構によって動機付けられる。実験変数の制御と生理学的パラメータの反復との間にはしばしばトレードオフがある。振り子スタイルのデバイスは、1つのジョイント面が第2のサーフェス14,16,17,18上で自由に平行移動する単純な振り子の支点として無傷のジョイントを利用する。無傷の関節を使用する代わりに、摩擦測定は、軟骨外植体を所望の表面14、19、20、21、22、23、24、25上にスライドさせることによって得ることができる。報告された関節軟骨の摩擦係数は、動作条件に応じて広い範囲(0.002〜0.5)にわたって変化している14,26。回転運動23,27,28を複製する装置が作成されている。Gleghorn et al.26は、Stribeck曲線解析を用いて軟骨潤滑プロファイルを観察するためのマルチウェルカスタム摩擦計を開発し、平らなガラスのカウンターフェースに対して軟骨間に線形振動摺動運動を適用した。
この装置は、摩擦応答を単離し、様々な負荷条件下での生体組織の機械生物学を探索することを目的としている。この装置は、純粋な転がり運動における抵抗が関節軟骨29の測定された摩擦係数に対して無視できるという理解のもとに、転がり運動と摺動運動の両方を近似することができる圧縮摺動による関節関節をシミュレートする単純化された試験セットアップを採用している。もともと関節軟骨9の摩擦応答に対する間質液加圧の影響を研究するために構築されたこの試験機は、軟骨10の表面ゾーンを除去する摩擦効果、滑液11の潤滑効果、軟骨摩耗仮説5、6、30、滑膜オン組織摩擦測定13などのトピックを探求するために使用されてきました。.摩擦試験バイオリアクターは、無菌条件下で摩擦実験を行うことができ、摩擦力が生きている軟骨および滑膜のメカノ生物学的応答にどのように影響するかを探る新しいメカニズムを提供する。この設計は、二節骨関節に関連する適用された生理学的負荷に応答して生きている関節組織の物理的調節を研究するための生物模倣バイオリアクターとして使用することができる。
この研究は、さまざまな接触応力および異なる潤滑浴における滑膜軟骨摩擦試験の構成を提示する。ほとんどの関節の関節表面積は、かなりの程度まで、滑膜組織31である。滑膜対軟骨摺動は一次耐荷重面では起こらないが、2つの組織間の摩擦相互作用は依然として組織レベルの修復および細胞メカノトランスダクションに重要な意味を持つ可能性がある。滑膜の内膜層上に存在する線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)は、流体誘発性剪断応力32に応答するメカノ感受性であることが以前に示されている。ストレッチ33、34 および流体誘起剪断応力35 がFLS潤滑剤製造を調節することも実証されている。そのようなものとして、滑膜と軟骨との間の直接摺動接触は、滑膜内の常駐細胞に別の機械的刺激を提供し得る。
滑膜摩擦係数に関する報告はごくわずか31,36件公開されている。Estellら13は、生物学的に関連するカウンターフェイスを利用して、以前の特徴付けを拡大しようとした。摩擦試験装置の生体組織検査能力により、関節関節中の生理学的組織相互作用を模倣し、滑膜細胞機能に対する接触せん断応力の役割と、滑膜と軟骨のクロストークへの寄与を解明することができる。後者は、関節炎および傷害後の滑膜関節炎症の媒介に関与している。軟骨が滑膜および滑液に物理的に近接しているため、軟骨は軟骨形成を含む多能性能力を示す滑膜細胞を含み、滑膜細胞は軟骨の恒常性において役割を果たし、関節表面に生着することによって修復することが仮定される。この文脈において、軟骨−滑膜および滑膜−滑膜の物理的接触および相互剪断は、軟骨損傷の領域への滑膜細胞のアクセシビリティを増加させ得る37、38、39、40。滑膜と軟骨の配置を利用した研究は、関節総組織力学とトライボロジーに関する洞察を提供するだけでなく、関節の健康を維持するための新しい戦略にもつながる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
軟骨が圧縮力、引張力、および剪断力、ならびに静水圧および浸透圧44,45にさらされるため、関節内に動的機械的環境が存在する。軟骨は関節の主な耐荷重組織であるが、滑膜はまた、軟骨表面および組織が折り畳まれる領域におけるそれ自体との摩擦相互作用を受ける。軟骨と滑膜との間の物理的相互作用は、細胞を転移させ、間葉系幹細胞を関…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、整形外科科学研究財団、NIH 5R01 AR068133、NIH TERC 5P41EB027062、およびNIGMS R01 692 GM083925(Funder ID:10.13039/100000057)の支援を受けた。
Materials
| Aluminum foil | Reynolds Group Holdings | Reynolds Wrap | Sterile tissue harvest |
| Aluminum-framed acrylic enclosure | Custom made | Friction tester component | |
| Autoclavable instant sealing sterilization pouches | Fisherbrand | 01-812-54 | Sterilization of tools |
| Autoclave | Buxton | Sterilization of tools | |
| Beaker (250 mL) | Pyrex Vista | 70000 | Tissue harvest |
| Betadine (Povidone Iodine Prep Solution) | Medline Industries, LP | MDS093906 | Sterile tissue harvest |
| Biological safety cabinet | Labconco | Purifier Logic+ Class II, Type A2 BSC | Sterile tissue harvest |
| Biospy punch | Steritool Inc. | 50162 | Tissue harvest |
| Box cutter | American Safety Razor Company | 94-120-71 | Tissue harvest |
| Circular acrylic-sillicone post (synovium) | Custom made | Tissue mounting | |
| Culture media | Custom made | DMEM (Cat No. 11-965-118; Gibco) supplemented with 50 μg/mL L-proline (Cat. No. P5607; Sigma), 100 μg/mL sodium pyruvate (Cat. No. S8636; Sigma), 1% ITS (Cat. No. 354350; Corning), and 1% antibiotic–antimycotic (Cat. No. 15-240-062, Gibco) | |
| Cyanoacrylate (Loctite 420 Clear) | Henkel | 135455 | Tissue mounting |
| Dead weights | OHAUS | Normal load | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | Dilute to 70 % |
| Fixed base | ThorLabs, Inc. | SB1T | Friction tester component |
| Forceps (synovium harvest) | Fine Science Tools | 11019-12 | Tissue harvest |
| Forceps (synovium mounting) | Excelta | 3C-S-PI | Tissue mounting |
| Horizontal linear encoder (for translating stage) | RSF Electronics, Inc. | MSA 670.63 | Friction tester component; system resolution of 1 µm |
| Hot glue gun and glue | FPC Corporation | Surebonder Pro 4000A | Tissue mounting |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | LabVIEW 2010 | Friction testing program |
| Load cell | JR3 Inc. | 20E12A-M25B | Friction tester component; 0.0019 lbs resolution in x&y, 0.0038 lbs resolution in z |
| Loading platen | Custom made | Tissue mounting | |
| O-ring | Parker | S1138AS568-009 | Tissue mounting |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | 351007 | Tissue mounting |
| PivotLok Work Positioner (tibia holder) | Industry Depot, Pivot Lok | PL325 | Tissue harvest |
| Removable base | ThorLabs, Inc. | SB1B | Friction tester component |
| Ring stand | Tissue harvest | ||
| Scalpel blades | Havel's Inc. | FSC22 | Tissue harvest |
| Scalpel handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | No. 4 | Tissue harvest |
| Screwdriver | Wera | 3334 | Tissue harvest |
| Stage | JMAR | Friction tester component | |
| Stepper motor | Oriental Motor Co., Ltd. | PK266-03B | Friction tester component |
| Suction tool | Virtual Industries, Inc. | PEN-VAC Vacuum Pen | Tissue mounting |
| Support rod | Custom made | Tissue mounting | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | Tissue mounting |
| Synovial fluid (bovine) | Animal Technologies, Inc. | Friction testing bath | |
| Testing bath | Custom made | Phosphate-Buffered Saline (PBS) with protease inhibitors: 0.04% isothiazolone-base biocide (Proclin 950 Cat. No. 46878-U; Sigma) and 0.1% protease inhibitor – 0.05 M ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA (Cat. No. 0369; Sigma) | |
| Tissue culture incubator | Fisher Scientific | Isotemp | Sterile culture |
| Vertical linear encoder (for loading stage) | Renishaw | T1031-30A | Friction tester component; 20 nm resolution |
| Voice coil actuator | H2W Technologies | NCC20-15-027-1RC | Friction tester component |
Referências
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