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Bioengenharia

Ein Reibungsprüf-Bioreaktorgerät zur Untersuchung der Synovialgelenksbiomechanik, Mechanobiologie und physikalischen Regulation

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63880
, , , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Columbia University, 2Department of Mechanical Engineering,Columbia University, 3Department of Orthopedic Surgery,Columbia University

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Reibungsprüfvorrichtung, die gleichzeitig reziprokes Gleiten und normale Belastung auf zwei sich berührende biologische Gegenflächen anwendet.

Abstract

Bei der primären Osteoarthritis (OA) hemmt normaler “Verschleiß” im Zusammenhang mit dem Altern die Fähigkeit des Knorpels, seine Trag- und Schmierfunktionen aufrechtzuerhalten, und fördert eine schädliche physikalische Umgebung. Die Reibungswechselwirkungen von Gelenkknorpel und Synovia können die Gelenkhomöostase durch Verschleiß auf Gewebeebene und zelluläre Mechanotransduktion beeinflussen. Um diese mechanischen und mechanobiologischen Prozesse zu untersuchen, wird ein Gerät beschrieben, das in der Lage ist, die Bewegung des Gelenks zu replizieren. Das Reibungsprüfgerät steuert die Abgabe von reziproken Übersetzungsbewegungen und normaler Belastung an zwei sich berührende biologische Gegenflächen. Diese Studie verwendet eine Synovium-auf-Knorpel-Konfiguration, und Reibungskoeffizientenmessungen werden für Tests vorgestellt, die in einem phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) oder Synovialflüssigkeitsbad (SF) durchgeführt werden. Die Tests wurden für eine Reihe von Kontaktspannungen durchgeführt, wobei die Schmiereigenschaften von SF unter hohen Belastungen hervorgehoben wurden. Dieses Reibungsprüfgerät kann als biomimetischer Bioreaktor zur Untersuchung der physikalischen Regulation von lebendem Gelenkgewebe als Reaktion auf angewandte physiologische Belastung im Zusammenhang mit der diarthrodialen Gelenkartikulation verwendet werden.

Introduction

Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende, degenerative Gelenkerkrankung, von der mehr als 32 Millionen amerikanische Erwachsene betroffen sind, mit Gesundheits- und sozioökonomischen Kosten von über 16,5 Milliarden US-Dollar1. Die Krankheit ist klassischerweise durch den Abbau von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen gekennzeichnet; Veränderungen an der Synovia haben jedoch kürzlich Anerkennung gefunden, da Synovitis mit OA-Symptomen und Progression in Verbindung gebracht wurde 2,3,4. Bei primärer (idiopathischer) OA hemmt normaler “Verschleiß”, der mit dem Altern verbunden ist, die Fähigkeit des Knorpels, seine Trag- und Schmierfunktionen aufrechtzuerhalten. Es hat sich gezeigt, dass die Spannungen, die durch längeren Gleitkontakt von Gelenkknorpelschichten oder Gleitkontakt von Knorpel gegen Implantatmaterialien erzeugt werden, den Delaminationsverschleiß durch Ermüdungsversagen unter der Oberfläche erleichtern 5,6. Da innerhalb des Gelenks eine dynamisch-mechanische Umgebung existiert7,8, können die Reibungswechselwirkungen von Gelenkknorpel und Synovia die Gelenkhomöostase durch Verschleiß auf Gewebeebene und zelluläre Mechanotransduktion beeinflussen. Um diese mechanischen und mechanobiologischen Prozesse zu untersuchen, wurde ein Gerät entwickelt, das die Bewegung des Gelenks mit strenger Kontrolle über die Druck- und Reibungsbelastung 5,6,9,10,11,12,13 repliziert.

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Reibungsprüfgerät, das reziproke, übersetzende Bewegung und Druckbelastung an Kontaktflächen lebender Gewebeexplantate liefert. Das computergesteuerte Gerät ermöglicht dem Benutzer die Kontrolle über die Dauer jedes Tests, die aufgebrachte Last, den Bewegungsumfang der Übersetzungsstufe und die Übersetzungsgeschwindigkeit. Das Gerät ist modular aufgebaut und ermöglicht das Testen verschiedener Gegenflächen, wie z. B. Gewebe auf Gewebe (Knorpel auf Knorpel und Synovium auf Knorpel) und Gewebe auf Glas. Zusätzlich zu den funktionellen Messungen, die der Tester erhält, können Gewebe- und Schmierbadkomponenten vor und nach der Prüfung bewertet werden, um die biologischen Veränderungen zu bewerten, die durch ein bestimmtes experimentelles Regime vermittelt werden.

Studien zur Knorpeltribologie werden seit Jahrzehnten durchgeführt, und es wurden mehrere Techniken entwickelt, um Reibungskoeffizienten zwischen Knorpel und Glas und Knorpel auf Knorpel14,15 zu messen. Die verschiedenen Ansätze werden durch das Gelenk und/oder den interessierenden Schmiermechanismus motiviert. Es gibt oft einen Kompromiss zwischen der Kontrolle experimenteller Variablen und der Rekapitulation physiologischer Parameter. Pendelartige Geräte verwenden intakte Gelenke als Dreh- und Angelpunkt eines einfachen Pendels, bei dem eine Gelenkoberfläche frei über die zweite Oberfläche14,16,17,18 übersetzt wird. Anstatt intakte Fugen zu verwenden, können Reibungsmessungen durch gleitende Knorpelexplantationen über gewünschte Oberflächen 14,19,20,21,22,23,24,25 erhalten werden. Die berichteten Reibungskoeffizienten des Gelenkknorpels schwankten je nach Betriebsbedingungen über einen weiten Bereich (von 0,002 bis 0,5) 14,26. Geräte wurden entwickelt, um die Drehbewegung23,27,28 zu replizieren. Gleghorn et al.26 entwickelten ein kundenspezifisches Multi-Well-Tribometer, um Knorpelschmierprofile mithilfe der Strieck-Kurvenanalyse zu beobachten, und eine lineare oszillierende Gleitbewegung wurde zwischen Knorpel gegen eine flache Glasgegenfläche angewendet.

Dieses Gerät zielt darauf ab, Reibungsreaktionen zu isolieren und die Mechanobiologie lebender Gewebe unter verschiedenen Belastungsbedingungen zu erforschen. Das Gerät verwendet einen vereinfachten Testaufbau, der die Gelenkartikulation durch Druckgleiten simuliert, der sowohl die Roll- als auch die Gleitbewegung annähern kann, mit dem Verständnis, dass der Widerstand in reiner Rollbewegung relativ zum gemessenen Reibungskoeffizienten von Gelenkknorpel29 vernachlässigbar ist. Ursprünglich entwickelt, um die Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeitsdruckbeaufschlagung auf die Reibungsreaktion von Gelenkknorpel9 zu untersuchen, wurde der Tester seitdem verwendet, um Themen wie Reibungseffekte der Entfernung der oberflächlichen Zone von Knorpel 10, schmierende Effekte von Synovialflüssigkeit11, Knorpelverschleißhypothesen 5,6,30 und Synovium-auf-Gewebe-Reibungsmessungen13 zu untersuchen . Der Reibungstest-Bioreaktor kann Reibungsexperimente unter sterilen Bedingungen durchführen und bietet einen neuartigen Mechanismus, um zu untersuchen, wie Reibungskräfte die mechanobiologischen Reaktionen von lebendem Knorpel und Synovium beeinflussen. Dieses Design kann als biomimetischer Bioreaktor verwendet werden, um die physikalische Regulation von lebendem Gelenkgewebe als Reaktion auf angewandte physiologische Belastung im Zusammenhang mit der diarthrodialen Gelenkartikulation zu untersuchen.

Diese Studie stellt eine Konfiguration für die Synovium-auf-Knorpel-Reibungsprüfung über eine Reihe von Kontaktspannungen und in verschiedenen Schmierbädern vor. Die bewegliche Oberfläche der meisten Gelenke ist zu einem großen TeilSynovialgewebe 31. Während Synovium-auf-Knorpel-Gleiten an primären tragenden Oberflächen nicht auftritt, können die Reibungswechselwirkungen zwischen den beiden Geweben immer noch wichtige Auswirkungen auf die Reparatur auf Gewebeebene und die Zellmechanotransduktion haben. Es wurde bereits gezeigt, dass fibroblastenähnliche Synoviozyten (FLS), die sich auf der intimen Schicht der Synovia befinden, mechanosensitiv sind und auf flüssigkeitsinduzierte Scherspannungreagieren 32. Es wurde auch gezeigt, dass Dehnung 33,34 und flüssigkeitsinduzierte Schubspannung35 die FLS-Schmierstoffproduktion modulieren. Daher kann der direkte Gleitkontakt zwischen Synovium und Knorpel den ansässigen Zellen in der Synovia einen weiteren mechanischen Reiz verleihen.

Nur wenige Berichte über Synoviumreibungskoeffizienten wurden veröffentlicht31,36. Estell et al.13 versuchten, die vorherige Charakterisierung durch die Verwendung biologisch relevanter Gegenflächen zu erweitern. Mit der Fähigkeit des Reibungsprüfgeräts, lebendes Gewebe zu testen, ist es möglich, physiologische Gewebeinteraktionen während der Gelenkartikulation nachzuahmen, um die Rolle der Kontaktscherspannung auf die Synoviozytenfunktion und ihren Beitrag zum Übersprechen zwischen Synovia und Knorpel aufzuklären. Letzteres wurde mit der Vermittlung von Synovialgelenksentzündungen bei Arthritis und Post-Verletzungen in Verbindung gebracht. Aufgrund der physikalischen Nähe von Knorpel zu Synovium und Synovialflüssigkeit, die Synoviozyten enthalten, die eine multipotente Kapazität aufweisen, einschließlich Chondrogenese, wird postuliert, dass Synoviozyten eine Rolle bei der Knorpelhomöostase und -reparatur spielen, indem sie auf die Gelenkoberfläche gepfropft werden. In diesem Zusammenhang kann der physische Kontakt und die gegenseitige Scherung von Knorpel-Synovium und Synovium-Synovium die Zugänglichkeit von Synoviozyten zu Regionen mit Knorpelschädenerhöhen 37,38,39,40. Studien, die Synovium-auf-Knorpel-Konfigurationen verwenden, werden nicht nur Einblicke in die Mechanik und Tribologie des groben Gewebes der Gelenke liefern, sondern auch zu neuen Strategien zur Erhaltung der Gelenkgesundheit führen.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurden juvenile Kniegelenke von Rindern verwendet, die aus einem lokalen Schlachthof gewonnen wurden. Studien mit solchen Rinderproben sind vom Columbia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ausgenommen. 1. Auslegung der Reibungsprüfeinrichtung HINWEIS: Eine schematische Darstellung des Reibungsprüfgeräts ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Gerät ist auf einer starren Grundpla…

Representative Results

Eine Synovium-auf-Knorpel-Konfiguration wurde verwendet, um juvenile Rinderexplantationen zu reiben. Die Synovia wurde auf einer Acryl-Ladeplatte mit einem Durchmesser von 10 mm montiert, so dass die Innenschicht mit dem darunter liegenden Knorpel in Kontakt kam. Als Knorpel-Gegenfläche wurde ein Tibiastreifen verwendet (Abbildung 6A). Tibialstreifen wurden mit einer Tiefe von ca. 1,4 mm und einer Größe von 10 mm x 30 mm geschnitten. Die Proben wurden 1 h bei 37 °C in einem phosphatgepuf…

Discussion

Innerhalb des Gelenks besteht eine dynamisch-mechanische Umgebung, da Knorpel Druck-, Zug- und Scherkräften sowie hydrostatischen und osmotischen Drücken ausgesetzt ist44,45. Obwohl Knorpel das wichtigste tragende Gewebe des Gelenks ist, erfährt die Synovia auch Reibungswechselwirkungen mit der Knorpeloberfläche und mit sich selbst in Regionen, in denen sich das Gewebe faltet. Die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Knorpel und Synovium sind wahrscheinli…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Orthopaedic Scientific Research Foundation, NIH 5R01 AR068133, NIH TERC 5P41EB027062 und NIGMS R01 692 GM083925 (Funder ID: 10.13039/100000057) unterstützt.

Materials

Aluminum foil Reynolds Group Holdings Reynolds Wrap Sterile tissue harvest
Aluminum-framed acrylic enclosure Custom made Friction tester component
Autoclavable instant sealing sterilization pouches Fisherbrand 01-812-54 Sterilization of tools
Autoclave Buxton Sterilization of tools
Beaker (250 mL) Pyrex Vista 70000 Tissue harvest
Betadine (Povidone Iodine Prep Solution) Medline Industries, LP MDS093906 Sterile tissue harvest
Biological safety cabinet Labconco Purifier Logic+ Class II, Type A2 BSC Sterile tissue harvest
Biospy punch Steritool Inc. 50162 Tissue harvest
Box cutter American Safety Razor Company 94-120-71 Tissue harvest
Circular acrylic-sillicone post (synovium) Custom made Tissue mounting
Culture media Custom made DMEM (Cat No. 11-965-118; Gibco) supplemented with 50 μg/mL L-proline (Cat. No. P5607; Sigma), 100 μg/mL sodium pyruvate (Cat. No. S8636; Sigma), 1% ITS (Cat. No. 354350; Corning), and 1% antibiotic–antimycotic (Cat. No. 15-240-062, Gibco)
Cyanoacrylate (Loctite 420 Clear) Henkel 135455 Tissue mounting
Dead weights OHAUS Normal load
Ethanol 200 proof Decon Labs, Inc. 2701 Dilute to 70 %
Fixed base ThorLabs, Inc. SB1T Friction tester component
Forceps (synovium harvest) Fine Science Tools 11019-12 Tissue harvest
Forceps (synovium mounting) Excelta 3C-S-PI Tissue mounting
Horizontal linear encoder (for translating stage) RSF Electronics, Inc. MSA 670.63 Friction tester component; system resolution of 1 µm
Hot glue gun and glue FPC Corporation Surebonder Pro 4000A Tissue mounting
LabVIEW National Instruments Corporation LabVIEW  2010 Friction testing program
Load cell JR3 Inc. 20E12A-M25B Friction tester component; 0.0019 lbs resolution in x&y, 0.0038 lbs resolution in z
Loading platen Custom made Tissue mounting
O-ring Parker S1138AS568-009 Tissue mounting
Petri dish (60 mm) Falcon 351007 Tissue mounting
PivotLok Work Positioner (tibia holder) Industry Depot, Pivot Lok PL325 Tissue harvest
Removable base ThorLabs, Inc. SB1B Friction tester component
Ring stand Tissue harvest
Scalpel blades Havel's Inc. FSC22 Tissue harvest
Scalpel handle FEATHER Safety Razor Co., Ltd. No. 4 Tissue harvest
Screwdriver Wera 3334 Tissue harvest
Stage JMAR Friction tester component
Stepper motor Oriental Motor Co., Ltd. PK266-03B Friction tester component
Suction tool Virtual Industries, Inc. PEN-VAC Vacuum Pen Tissue mounting
Support rod Custom made Tissue mounting
Surgical scissors Fine Science Tools 14061-09 Tissue mounting
Synovial fluid (bovine) Animal Technologies, Inc. Friction testing bath
Testing bath Custom made Phosphate-Buffered Saline (PBS) with protease inhibitors: 0.04% isothiazolone-base biocide (Proclin 950 Cat. No. 46878-U; Sigma) and 0.1% protease inhibitor – 0.05 M ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA (Cat. No. 0369; Sigma)
Tissue culture incubator Fisher Scientific Isotemp Sterile culture
Vertical linear encoder (for loading stage) Renishaw T1031-30A Friction tester component; 20 nm resolution
Voice coil actuator H2W Technologies NCC20-15-027-1RC Friction tester component
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Gangi, L. R., Petersen, C. A., Oungoulian, S. R., Estell, E. G., Durney, K. M., Suh, J. T., Ateshian, G. A., Hung, C. T. A Friction Testing-Bioreactor Device for Study of Synovial Joint Biomechanics, Mechanobiology, and Physical Regulation. J. Vis. Exp. (184), e63880, doi:10.3791/63880 (2022).
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